Informe técnico de avance de resultados

P. MENDOZA ZÉLIS; C. RODRIGUEZ TORRES; S. ONS; L. TRAVERSO; M. PRIDE; V. ROMANOWSKI; N. CAPRIOTTI; M. VOLONTÉ; L. AMOROS; G. LABORATO; L. FERRELI; M. FONTICELLI; P. SCHILARDI; L. JUNCAL; M. E. DE SOUSA; A. F. CABRERA; C. VERICAT

2020-01-01/2020-08-01

Química

Salud humana

Se fabricaron nanopartículas de magnetita (NPM, Fe3O4) por el método de coprecipitación, se recubrieron con sílice (SiO2) por hidrólisis de tetraetilortosilicato (TEOS). La composición y estructura de las partículas resultantes (PEM) se confirmó mediante microscopía electrónica. Por dispersión de luz se determinó que presentan un tamaño hidrodinámico entre 0,8 y 1,2 µm, potencial Z -42 mV. Las propiedades magnéticas se caracterizaron haciendo medidas de fuerza magnética y ciclos de histéresis magnética. Se preparó una solución con una concentración de 10 g/L para realizar las pruebas de extracción de RNA. Luego de pruebas preliminares en muestras provenientes de hisopados y cultivo celular pulmonar humano A549 se puso a punto un protocolo de extracción que contempla los pasos de: a) lisis (buffer GTC 4 M; Tris HCl pH 7, 6 - 8, 50 mM; Tritón X-100 4% y EDTA 20 mM; luego el pH fue ajustado a 6,5); b) agregado de PEM; c) agregado de isopropanol; d) aplicación campo magnético hasta clarificación; e) descarte del sobrenadante; f) lavado en isopropanol; g) dos lavados con etanol (en todos los lavados se descarta el sobrenadante una vez fijadas las PEM con un campo magnético externo; g) elución del RNA en agua. Se realizaron pruebas con pseudovirus y con muestras de cultivo de una línea celular pulmonar humana A549. Se determinó la cantidad y pureza del RNA obtenido mediante electroforesis, espectrofotometría y RTqPCR. Se obtuvieron muy buenos rendimientos y calidades de RNA con valores de Ct (cycle threshold) que difieren en menos de 1 unidad con los obtenidos para los RNA purificadosmediante columnas de sílice. Sin embargo, aún no se ha logrado alcanzar el rendimiento de los kits comerciales de perlas magnéticas cuando se utilizan en la extracción de RNA de muestras clínicas, por lo que se está trabajando para optimizar ese aspecto