Informe Final de Beca Interna de Formación de Postgrado Cofinanciada CONICET/PORFENC SRL

MORAGA, N. B.

2006-11-02/2007-05-15

Biológica

Sanidad animal-Prevencion y profilaxis

Estudios de los parámetros involucrados en la producción y biopreservación de bacterias probióticas a escala industrial OBJETIVOS 1.Diseño de un medio de cultivo adecuado para la producción a gran escala de potenciales bacterias probióticas. 2.Optimización de los parámetros operacionales (temperatura, agitación, aireación, control de pH, etc). 3.Análisis y caracterización de diferentes recubrimientos protectores para extender o asegurar la viabilidad de la cepa probiótica. 4.Ensayos in vitro para determinar el efecto del encapsulado. 5.Estudios exploratorios in vivo con las bacterias encapsuladas o protegidas. METODOLOGÍA 1. Cepas de bacterias lácticas y/o del género Bacillus. Las bacterias que se utilizarán en este trabajo fueron aisladas, caracterizadas y estudiadas por el grupo de trabajo: Enterococcus faecium CRL1385, Lactobacillus salivarius CRL1384, Enterococcus avium DSMZ17511, varias cepas de Ent. faecium productores de bacteriocinas aislados de miel del  NOA y diferentes cepas de Bacillus spp. (Audisio 1999; Audisio y col., 1999a y b, 2000, 2001, 2005; Audisio y Carrillo 2004; Audisio y Apella 2006).2. Diseño del medio de cultivo. Se analizará el uso de diferentes fuentes de nutrientes que sean accesibles y económicas. Se probarán distintas combinaciones y se tratará de formular un medio de cultivo óptimo y barato para la producción de biomasa a gran escala. 3. Optimización de los parámetros vinculados con la fermentación. Se estudiará para cada género (Lactobacillus, Enterococcus y Bacillus) las condiciones óptimas de crecimiento, en primer lugar en un fermentador de 3L, luego en uno de 10L y se avanzará en el escalamiento. Cabe destacar que el caso particular de Bacillus, se elegirán las condiciones óptimas para conseguir un alto porcentaje de esporulación porque para especies de este género bacteriano se buscan esporas y no células vegetativas. 4. Encapsulado de las bacterias. Se estudiarán  diferentes técnicas de encapsulado. 4.1. Encapsulado mediante hidrocoloides:a) extrusión o goteo: se utilizan soluciones de alginato de sodio en las que se suspenden las células y se vierten sobre una solución que contiene un catión multivalente (usualmente Ca2+) para formar las cápsulas o perlas. b) emulsión o sistema de dos fases: los materiales usados con esta técnica son mezclas de  carragenano y goma de algarrobo, derivados de celulosa, alginato, quitosano y gelatina. 4.2. Encapsulado mediante secado por spray. Permite producir cápsulas a partir de suspensiones acuosas de microorganismos con diferentes matrices poliméricas como proteínas, almidones, dextrinas, etc. 5. Materiales para diseñar las cápsulas. Se estudiarán como matrices poliméricas algunos compuestos autóctonos como la goma brea, goma de algarrobo. Además, se analizarán proteínas de soja, suero de leche, almidones y otros disponibles comercialmente como alginato, carragenato, derivados de celulosa, derivados del almidón, gelatina, dextrinas. 6. Caracterización y evaluación de las cápsulas. Previo a su utilización en el encapsulado de bacterias se caracterizarán los recubrimientos o cápsulas formadas con los polímeros elegidos en cuanto a su solubilidad en agua, ácidos, sales biliares, resistencia mecánica (texturómetro), termogravimetría (DSC) (Bertuzzi 2003; Bertuzzi y col., 2002 a y b, 2003, 2004). Las cápsulas se caracterizarán morfológicamente a través de microscopía electrónica de barrido (SEM). 7. Resistencia de las bacterias encapsuladas al vehículo, almacenamiento y al ambiente gastrointestinal. Se analizará in vitro la retención de los microorganismos en las cápsulas y su viabilidad frente a factores de estrés de como acidez clorhídrica, sales biliares, acción de pepsina, amilasas y otros enzimas, osmolaridad, etc. 8. Ensayos in vivo. Se estudiará la sobrevida de las bacterias encapsuladas al tránsito gastrointestinal de las aves. Para ello, se analizarán muestras de materia fecal de diferentes lotes de aves: uno control, otro alimentado con el suplemento probiótico sin protección y un tercero alimentado con el suplemento probiótico protegido con el encapsulamiento de las células. 9. Procesamiento de la información. Los resultados experimentales se analizarán por el test F de análisis de la varianza, el test de Tukey HSD (Honest Significant Difference) para realizar comparaciones post-test y test univariado de Cochran, para homogeneidad de varianza. Los resultados, previa  conformidad por parte de la empresa, serán divulgados mediante publicaciones y presentaciones en reuniones científico-tecnológicas.2+) para formar las cápsulas o perlas. b) emulsión o sistema de dos fases: los materiales usados con esta técnica son mezclas de  carragenano y goma de algarrobo, derivados de celulosa, alginato, quitosano y gelatina. 4.2. Encapsulado mediante secado por spray. Permite producir cápsulas a partir de suspensiones acuosas de microorganismos con diferentes matrices poliméricas como proteínas, almidones, dextrinas, etc. 5. Materiales para diseñar las cápsulas. Se estudiarán como matrices poliméricas algunos compuestos autóctonos como la goma brea, goma de algarrobo. Además, se analizarán proteínas de soja, suero de leche, almidones y otros disponibles comercialmente como alginato, carragenato, derivados de celulosa, derivados del almidón, gelatina, dextrinas. 6. Caracterización y evaluación de las cápsulas. Previo a su utilización en el encapsulado de bacterias se caracterizarán los recubrimientos o cápsulas formadas con los polímeros elegidos en cuanto a su solubilidad en agua, ácidos, sales biliares, resistencia mecánica (texturómetro), termogravimetría (DSC) (Bertuzzi 2003; Bertuzzi y col., 2002 a y b, 2003, 2004). Las cápsulas se caracterizarán morfológicamente a través de microscopía electrónica de barrido (SEM). 7. Resistencia de las bacterias encapsuladas al vehículo, almacenamiento y al ambiente gastrointestinal. Se analizará in vitro la retención de los microorganismos en las cápsulas y su viabilidad frente a factores de estrés de como acidez clorhídrica, sales biliares, acción de pepsina, amilasas y otros enzimas, osmolaridad, etc. 8. Ensayos in vivo. Se estudiará la sobrevida de las bacterias encapsuladas al tránsito gastrointestinal de las aves. Para ello, se analizarán muestras de materia fecal de diferentes lotes de aves: uno control, otro alimentado con el suplemento probiótico sin protección y un tercero alimentado con el suplemento probiótico protegido con el encapsulamiento de las células. 9. Procesamiento de la información. Los resultados experimentales se analizarán por el test F de análisis de la varianza, el test de Tukey HSD (Honest Significant Difference) para realizar comparaciones post-test y test univariado de Cochran, para homogeneidad de varianza. Los resultados, previa  conformidad por parte de la empresa, serán divulgados mediante publicaciones y presentaciones en reuniones científico-tecnológicas.