Informe Técnico Fontar ANR-2011-2

RECAVARREN M; QUINTANA S; MARIN M; MORRELL E

2012-02-01/2013-12-31

Biológica

Sanidad animal-Enfer. infec. bacterianas

Introducción. Es una enfermedad zoonótica causada por la bacteria Leptospira interrogans que en el ganado bovinoproduce mortandad embrionaria, abortos y/o nacimiento de animales débiles e infertilidad. La transmisión al hombre ya otros animales se opera por contaminación de agua, suelo, alimentos, y materiales con condiciones fisicoquímicasapropiadas (humedad, nutrientes). La prueba de referencia MAT detecta AC específicos pero tiene sensibilidadlimitada en la fase aguda y requiere un 2° muestreo confirmatorio, por lo tanto, mayor tiempo y costo. Otra de lastécnicas utilizadas es la inmunofluorescencia directa pero esta requiere un observador experto para la identificación dela bacteria en la muestra de tejido.Objetivo: Desarrollar una técnica de PCR en Tiempo Real para detectar ADN de los serovares más comunes deLeptospira que infectan a bovinos, a partir de cultivos puros y, a partir de muestras de bovinos comparando losresultados de la PCR en Tiempo Real con los obtenidos por la técnica de Inmunofluorescencia Directa.Materiales y Métodos. Cultivos puros: Se utilizaron cultivos de cepas de referencia de Leptospira interrogansserovares Canicola, Pomona, Pyrogenes, Ballum e Icterohaemorrhagiae. Muestras de bovinos: 10 muestras de fetosabortados de bovinos sospechosos de tener leptospirosis, fueron conservadas a -20°C para su posterior análisis porInmunofluorescencia directa (IFD) y por PCR en Tiempo Real. Todos los fetos presentaban lesiones histopatolgóciasen hígado (hepatitis periportal mononuclear), riñón (nefritis intersticial mononuclear) o en ambos tejidos.Inmunofluorescencia Directa: Se utilizó como técnica de rutina en los fetos el análisis de las improntas de hígado yriñón fetal. Las improntas se fijaron en acetona a 4 ºC durante 15 min; se dejaron secar a TA y se mantuvieronrefrigeradas hasta su procesamiento, como máximo dentro de los 7 días de su recolección. Se lavaron en PBS pH 7,2durante 10 min, se dejaron secar a TA y luego se les agregó un antisuero policlonal en conejo (Lepto Multivalentantiserum NVLS, EE.UU) marcado con fluoresceína en una dilución de 1:5. Posteriormente, las muestras se colocaronen cámara oscura húmeda y se incubaron a 37 ºC durante 45 min. Se lavaron las improntas en PBS pH 7,2 durante 10min en agitación constante y se dejaron secar. Luego se les aplicó un cubreobjeto montado con una gota de soluciónde glicerina bufferada pH 9,0. Finalmente, las muestras se observaron con microscopio de epifluorescencia (NikonFluophot, 40 X 1,3). En todos los casos se utilizaron controles positivos (improntas de riñón de hamsters previamenteinoculados con L. pomona y controles negativos. Reacciones de detección de ADN de Leptospira. Se llevaron a caboreacciones de PCR en tiempo real para detectar ADN de leptospira, utilizando los cebadores LipL32-270F y LipL32-692R que amplifican un fragmento de 423 pb y los cebadores Lepto F y Lepto R que generan un amplicón de 87 pb apartir de ADN de Leptospira sp. Resultados. Cultivos puros. Se logró extraer y amplificar exitosamente el ADN de loscultivos de los diferentes serovares de Leptospira Interrogans. Se calculó la sensibilidad analítica con ambos pares decebadores (n° de genomas detectados a partir de los cultivos puros). La sensibilidad fue calculada realizandodiluciones seriadas de ADN de concentración conocida y analizando las mismas por PCR en tiempo real con ambospares de cebadores. La sensibilidad calculada para los serovares Canicola, Pomona, Pyrogenes, Ballum eIcterohaemorrhagiae fue en promedio de 8 genomas. Las eficiencias de reacción para todos los serovares fueronsemejantes (>90%). Se estudió la especificidad de ambos pares de cebadores con ADN de otras bacterias (Escherichiacoli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aureginosa, Streptococcus neumoniae,Salmonella entérica, Clostridium perfringens, Enterococus sp, Bacillus cereus, Rodococus sp, Brucella abortus) enla cual en ninguno de los casos se amplificó el fragmento específico de 87 y 423 pb, respectivamente (Figura 2).De las 10 muestras procesadas, 6 fueron positivas por PCR en Tiempo Real (60%). Probablemente no fue posibledetectar ADN de Leptospira en la totalidad de las muestras debido a que fueron tomadas de diferentes sitiosanatómicos para la realización de la IFD y la extracción de ADN.Seis de las muestras analizadas resultaron positivas con la PCR de 87 pb, y negativas por la PCR de 423 pb (muestras04 454, 04 287, 04 327, 05 580, 05 448, 04 222; tabla 2). Se atribuye esta falta de amplificación con los cebadores de423 pb a los altos niveles de degradación que suelen presentar este tipo de muestras que son almacenadas ytransportadas desde establecimientos alejados, en muchos casos sin la refrigeración adecuada. Por esta razón esimportante para la realización de un correcto diagnóstico molecular, la utilización de cebadores que amplifiquenfragmentos pequeños de ADN para no tener resultados falsos negativos debido a la alta degradación del ADN de lamuestra.ConclusionesSe desarrolló exitosamente una técnica de PCR en Tiempo Real que detectó ADN de los serovares más comunes de Leptospira que infectan a bovinos, a partir de cultivos puros y de muestras clínicas de fetos abortados de bovinos.La sensibilidad de la técnica de PCR en Tiempo Real a partir de cultivos puros de Leptospira Interrogans, serovares Castellonis, Canicola, Icterohaemorragiae, Pyrogenes y Pomona fue en promedio de 8 genomas y confirman la utilidad de la técnica, ya que con muy poco material obtenido, permite arrojar resultados precisos que evidencian la presencia del ADN de Leptospira, en un tiempo de reacción muy corto (