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. INTRODUCCION En la actualidad ha cobrado importancia la preservación natural de los alimentos, evitando la utilización de conservantes o aditivos químicos. El aumento y diseminación rápida de bacterias patógenas multiresistentes ha forzado la consideración de métodos alternativos para combatir infecciones.En la búsqueda de alternativas para el tratamiento de las enfermedades invasivas, diversos estudios han demostrado la utilidad de los probióticos, bacteriocinas de probióticos y extractos bacterianos, por sus propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras.. Los probióticos son definidos por la Organización de los Alimentos y Agricultura (FAO) como: Microorganismos vivos, que al ser administrados en dosis adecuadas, confieren un beneficio de salud al receptor. Durante la primera reunión de ISAPP (Internacional Scientific Association for Probiotics and Prebiotics) se redefinieron los términos: Probióticos como microorganismos viables que se administran en cantidades adecuadas al huésped para cumplir con una función fisiológica definida, Prebióticos como sustancias no digeribles que promueven el crecimiento diferencial de bacterias benéficas y Simbióticos como una combinación de ambos. Las bacterias ácido lácticas (BAL) son las mas utilizadas para este propósito. Un requisito para que las bacterias lácticas sean efectivas como cultivos protectores, es la adaptación a las condiciones imperantes en el correspondiente producto, aunque también deben presentar capacidad competitiva. En la mayor parte de los productos cárnicos tienen que tolerar concentraciones de sal relativamente elevadas y deben poder desarrollarse en presencia de nitrito y a temperaturas relativamente bajas Los enterococos, son BAL y pueden predominar sobre la microbiota presente en los distintos ambientes donde viven. Sus actividades antimicrobianas se han reconocido desde mediados del siglo XX y son particularmente importantes en la ecología intestinal y en la fermentación y preservación de los alimentos. La resistencia de los enterococos a las temperaturas de pasteurización y su adaptabilidad a los diferentes sustratos y condiciones de de desarrollo (temperaturas extremas alta y baja, pH y salinidad) implica que pueden encontrarse en alimentos manufacturados de materiales crudos (lácteo o cárnico) y en alimentos térmicamente tratados. Por lo tanto los enterococos pueden constituir una parte importante de la flora natural de los alimentos, especialmente productos fermentados de origen cárnico y lácteo. Estudios realizados sobre la microbiota en quesos han demostrado que los enterococos tienen un papel importante en su maduración y contribuyen a su sabor y olor característicos. Los enterococos también están presentes en otros alimentos fermentados de origen cárnico como los embutidos crudos (salame). Las bacterias patógenas como Salmonella, Escherichia coli productor de verotoxina como el serotipo O157:H7 entre otros, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens pueden contaminar la carne y en muchos casos provocar enfermedades infecciosas invasivas en seres humanos. A continuación se describen algunos géneros bacterianos más importantes y las consecuentes enfermedades, que pueden presentarse en caso de ingerir alimentos con alta carga bacteriana. Salmonella: La mayoría de las personas infectadas con Salmonella presentan diarrea, fiebre y calambres abdominales de 12 a 72 horas después de la infección. El proceso infeccioso tiene una duración aproximada de 4 a 7 días y la mayoría de las personas se recuperan sin tratamiento. Sin embargo, en algunas personas la diarrea puede ser tan aguda que el paciente necesite hospitalización. En estos pacientes, la infección con Salmonella puede propagarse de los intestinos a la corriente sanguínea y, después, a otras partes del cuerpo y puede ocasionar la muerte a menos que la persona reciba tratamiento expedito con antibióticos. Los ancianos, los lactantes y quienes tienen el sistema inmunológico deteriorado son las personas más susceptibles de contraer una enfermedad grave. Escherichia. coli productor de verotoxina 0157:H7: Esta bacteria se adquiere preferentemente a partir del consumo de alimentos de origen animal contaminados, cocinados insuficientemente. La particularidad que caracteriza a este microorganismo es su capacidad para producir cuadros entéricos, hemorrágicos, que pueden evolucionar a situaciones muy graves como el síndrome urémico hemolítico (SUH) o la púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) y, que son la causa de un tremendo impacto social. Esta bacteria tiene capacidad para sobrevivir a condiciones ácidas (pH 2,5 a 3), crecer a muy bajas temperaturas (7ºC) y permanecer viables durante varios meses en productos congelados (por ejemplo, en carne congelada a -20ºC). En estudios experimentales se ha comprobado que E. coli 0157:H7 sobrevive durante 2 meses a 4ºC en embutidos fermentados secos, con una reducción apreciable de unas 100 veces el número inicial y que concentraciones del 1,5% de ácido acético, cítrico y láctico en carne, no parecen afectarle significativamente. Listeria monocytogenes: es una bacteria ampliamente difundida en la naturaleza. Su presencia en los alimentos esta determinada por su extensa distribución en el ambiente - tierra, aguas servidas, materia fecal, vegetación, ensilados y entorno de la producción de alimentos - lo que confiere una importante oportunidad para contaminarlos. Merece enfatizarse la baja temperatura a que se multiplica la bacteria como el amplio rango de pH al que crece. L. monocytogenes es relativamente resistente al calor si se encuentra en concentraciones muy elevadas del orden de 10 5 a 10 6 UFC/ml pero en bajos niveles se destruye a temperaturas de pasterización (71º C por 15 segundos). Clostridium. perfringens: Unas pocas bacterias pueden sobrevivir después de la cocción del alimento y si las condiciones ambientales lo permiten, se multiplican hasta llegar a la dosis infectante. Cuando las células vegetativas llegan al intestino y esporulan, producen la enterotoxina que es la responsable del cuadro clínico, una toxicoinfección caracterizada por náuseas, diarrea, dolor y gases abdominales, 6 a 12 horas después de haber ingerido los alimentos contaminados. Características del Probiótico E. faecalis CECT7121 La cepa E. faecalis CECT7121 fue depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (Burjasot, Valencia, España). Es una bacteria láctica ambiental saprófita, sin factores de virulencia, con actividad inhibitoria in vitro sobre numerosas cepas de bacterias Gram positivas como Listeria monocytogenes, Listeria spp, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis (E. faecalis CECT7121 tiene inmunidad a su actividad inhibitoria), E. faecium,E. durans, E. gallinarum-casseliflavus, Str. agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. uberis, Clostridium perfringens, C. sporogenes, Bacillus subtilis y B. cereus. También actúa sobre algunas bacterias Gram negativas como ciertas cepas de E. coli, Shigella sonnei y Sh. flexneri . Sin embargo, las bacterias ácido lácticas utilizadas como iniciadoras (starters) en alimentos fermentados como ciertas cepas de Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus son resistentes. También tiene acción inhibitoria sobre cepas Gram positivas con multiresistencia a los antibióticos (Staphylococcus aureus multiresistentes, enterococos resistentes a vancomicina, Str. pneumoniae resistente a penicilina) y sobre los principales agentes de mastitis bovina y endometritis en yeguas. La acción inhibitoria sucede a través de la producción de una bacteriocina o enterocina que se inactiva a 121º C, 15 min; con 2-mercaptoetanol y Tritón X-100. Es hidrofóbica y con actividad inhibitoria entre pH 4-8. Su masa molecular es de 5.000 Da. La cepa E. faecalis CECT7121 no tiene resistencia in vitro a los antibióticos de utilización habitual en clínica humana como ampicilina, gentamicina (120 µg), estreptomicina (300 µg), vancomicina, teicoplanina, tetraciclina y cloranfenicol. E. faecalis CECT7121 puede competir con los microorganismos nativos en las leches de cabra y de vaca y tiene actividad bactericida sobre L. monocytogenes, patógeno resistente a las condiciones ambientales y contaminante potencialmente presente en productos lácteos. También, tiene actividad inhibitoria sobre la flora bacteriana deteriorante (coliformes totales y fecales, estafilococos) presente en vegetales listos para su consumo durante su almacenamiento a 8º C. E. faecalis CECT7121 como biopreservante de productos cárnicos fermentados: En la elaboración de alimentos, las bacterias lácticas empleadas como cultivos protectores deben tener capacidad de adaptación a las condiciones imperantes en el correspondiente producto y también deben presentar capacidad competitiva. En la mayor parte de los productos cárnicos, las bacterias lácticas tienen que tolerar concentraciones de sal relativamente elevadas y deben poder desarrollarse en presencia de nitrito y a temperaturas relativamente bajas. Esta cepa coloniza los alimentos crudos de diferente origen animal y resiste condiciones ambientales adversas (calor, pH ácido, altas concentraciones de NaCl) y puede sobrevivir en los productos fermentados. También, esta cepa desempeña un importante papel en la preservación natural de productos cárnicos controlando el desarrollo de diversas bacterias patógenas o deteriorantes (coliformes, estafilococos). La preservación biológica de los alimentos es una alternativa importante a la conservación con compuestos químicos no biodegradables con toxicidad para el humano E. faecalis CECT7121 como PROBIÓTICO Cumple con los siguientes criterios: * tiene conducta no patogénica, es saprófito * exhibe resistencia a procesos tecnológicos, a los ácidos gástricos y a la bilis * se adhiere al tejido epitelial intestinal * es capaz de persistir, al menos por cortos períodos, en el tracto gastrointestinal * produce una sustancia antimicrobiana (bacteriocina de amplio espectro inhibitorio) Seguridad de la cepa Para descartar la potencial actividad patogénica de E. faecalis CETC7121 se empleó un modelo murino de sepsis sistémica. Se demostró la seguridad de la cepa ya que sólo trabajando con muy altas concentraciones de bacterias (>1x1011UFC/ml) se observó el quiebre de la respuesta inmunológica. Se realizaron experimentos para analizar la existencia del fenómeno de traslocación luego del implante intestinal en ratones BALB/C inmunocompetentes e inmunosuprimidos (con corticoides) con un inóculo de la cepa de 2,5 x 10 8 UFC/ml No se observó en la necropsia invasión sistémica de E. faecalis CECT7121 en hígado, pulmones, bazo, riñón y sangre. Capacidad de implantación Se estudió la capacidad de implantación al tejido intestinal en ratones BALB/c pre-tratados con E. faecalis CETC7121 por vía intragástrica. Se observó que la bacteria se implanta en el intestino de los animales y se mantiene por lo menos durante 6 días. Mediante el estudio microbiológico, se determinó que las enterobacterias se mantuvieron invariables con respecto al grupo control Conclusión: Resumen de características de la cepa · cepa saprófita · sin factores de virulencia · adherencia al epitelio intestinal · tolerancia al pH gástrico · resistencia a las sales biliares · efecto antiinflamatorio · acción sobre interleuquinas · acción sobre la inmunidad inespecífica, estimulándola · inhibe la proliferación de células tumorales como mieloma y linfoma. · protección contra la infección de patógenos como Salmonella, E coli Enterohemorrágica, Shigella spp · protección contra la infección de Toxocara canis, Cryptoporidium spp, Entamoeba spp, Giardia lamblia y Candida spp · Puede utilizarse como aditivo biopreservante en alimentos de origen vegetal, lácteo y carne, evitando la utilización de preservantes químicos OBJETIVO GENERAL El presente proyecto propone evaluar la eficacia de E. faecalis CETC7121 en la inhibición del crecimiento de microorganismos patógenos y/o contaminantes en carne picada de origen bovino, para asegurar su biopreservación y disminuir infecciones invasivas en poblaciones de riesgo. Objetivos Particulares: · Caracterizar en muestras de carne picada la presencia de la bacteria E. coli O157:H7 principal serotipo productor de la verototoxina (VTEC) responsable del S. Urémico Hemolítico en niños y gerontes. · Caracterizar en muestras de carne picada la presencia de otros serotipos de E. coli diaerrogénicas. · Caracterizar en muestras de carne picada la presencia de la bacteria Salmonella Enteritidis o S. Typhimurium y Cl. perfringens de relevancia en salud pública. · Valorar el desplazamiento de las cepas bacterianas autóctonas en la masa cárnica utilizando la cepa de E. faecalis CETC7121

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