INVESTIGADORES
KUHAR Jose Francisco
convenios, asesorías y/o servicios tecnológicos
Título:
DETERMINACIÓN MLECULAR DE HONGOS A PARTIR DE RAÍCES DE PINOS.
Autor/es:
FRANCISCO KUHAR; MARÍA BELÉN PILDAIN
Fecha inicio:
2014-05-01
Fecha finalización:
2014-06-01
Campo de Aplicación:
Produccion vegetal
Descripción:
dentificación de morfotipos en puntas de raíces micorrizadas y determinación molecular de tips de raíces de pinos con CTAB provistos por el Laboratorio CISPHoCoME Programa Hongos Comestibles. cada muestra fue lavada con agua estéril durante 10 min para remover los restos de CTAB. Luego se montaron las puntas bajo lupa para la determinación de los morfotipos siguiendo la bibliografía de Agerer (1994, 2001), Agerer & Rambold (2004-2013) y Goodman et al. (1996). De cada muestra se seleccionó un tip para la extracción de ADN. La extracción se realizó usando uREDEExtract-N-Amp Plant PCR kit; Sigma, St. Louis, Missouri). Se amplificó la región ITS (ITS1, 5.8S e ITS2) del operón rDNA utilizando los primers ITS1-F/ ITS4 (White et al. 1990; Gardes y Bruns 1993). La reacción de amplificación por PCR fue realizada con el kit REDExtract-N-Amp Plant PCR kit (Sigma, Missouri) siguiendo las condiciones del fabricante con las condiciones de ciclado propuestas por Gardes y Bruns (1993). La reacción se llevó a cabo en termociclador (My Cycler_, BioRad, Hercules, CA) y las condiciones fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 94°C (4 min), seguido por 35 ciclos de desnaturalización a 93°C (35s), primer annealing a 55°C (53s) y elongación a 72°C (30s + 5s por ciclo). El producto de la PCR fue visualizado y separado en un gel de agarosa 1% (w/v) con GelRed? Nucleic Acid Stain (Biotium Inc., Hayward, USA) y las bandas fueron visualizadas bajo luz UV. El fragmento amplificado fue purificado y secuenciado en un secuenciador automático (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) en la empresa Macrogen (Seúl, Corea). La búsqueda de la identidad de las secuencias obtenidas fue realizada en GenBank DNA database usando el algoritmo de búsqueda Gapped BlastN (Altschul et al. 1997). Similitudes por encima del 98% pueden ser tratadas como pertenecientes a la misma especie, mientras que la identificación a nivel de género se puede realizar a partir de un 90% de consenso.
