Convenio de Cooperación Internacional CONICET-CIHR

DAMASIA BECU-VILLALOBOS; DAVID HILL; VICTORIA A. LUX-LANTOS; EDITH ARANY

2005-01-01

2006-12-31

Biológica

Salud humana

Factores de crecimiento en la  función hipofisaria y pancreática A) La función y crecimiento de la hipófisis son dependientes de la acción coordinada de péptidos hipotalámicos e hipofisarios, y de las hormonas circulantes. Sin embargo, numerosos factores de crecimiento y sus receptores han sido identificados en la hipófisis anterior (Trends Endocrinol Metab 14:188:03), y se ha postulado que muchos de ellos producidos localmente modulan la función hipofisaria por mecanismos auto/paracrinos. Recientemente hemos descripto que en la hipófisis de hembras knockout para el receptor dopaminérgico D2 la expresión de VEGF está incrementada (trabajo en revisión). Si bien VEGF no induce la proliferación de células hipofisarias in vitro, como lo hace en células endoteliales (Nat Med 9:669:03), podría ser crítico para la adecuada angiogénesis de la hiperplasia que presentan estas hembras. Por otro lado se ha descripto que la  desnutrición en respuesta a una dieta baja en proteínas determina una marcada disminución de la actividad hipofisaria y afecta la función de los respectivos órganos blanco (Pediatr Res 38:747:95) . La proteína dietaria en etapas tempranas de la vida, en particular intrauterinamente, es determinante para el control del sistema nervioso central sobre la secreción de GH (J Endocrinol 150:231:96), así como para el desarrollo de la sensibilidad de las células beta del páncreas a la glucosa (Endocrinology 140:4861:99) (Diabetes 40 Suppl 2:115:91). La contraparte canadiense ha desarrollado el modelo de la restricción proteica a ratas a lo largo de la preñez y han demostrado que el páncreas endocrino es el principal órgano blanco que es dañado por la dieta baja en proteínas (LP). En particular, la LP dada durante la gestación disminuye la masa de células b pancreáticas y la vascularización de los islotes al nacimiento (Endocrinology 140:4861:99). Además, describieron que tanto el VEGF como su receptor Flk1 estaban disminuidos en células del islote en fetos con LP (J Nutr 133:2820:03),. La taurina tiene escasa disponibilidad en el suero de fetos de ratas con dieta LP y ellos demostraron que la suplementación con este aminoácido impedía el daño de la restricción proteica, y aumentaba el contenido de VEGF en páncreas (Diabetologia 45:856:02), lo que sugiere que la taurina tiene un rol potencial en la vasculogénesis de los islotes. En este contexto, la contraparte canadiense nos invita a realizar una colaboración en el área neuroendocrina para evaluar el rol de la taurina en la hipófisis en este modelo experimental de desnutrición prenatal. Es de destacar que ya hemos colaborado anteriormente con el LHRI, y publicado un trabajo (J Endocrinol 174:447:02) La taurina, un aminoácido de tipo inhibitorio en el sistema nervioso central, activa receptores en la hipófisis y se han descripto algunos efectos sobre la secreción hormonal, y la función de neurotransmisores hipotalámicos (Amino Acids 15:5:98; Endocrinology 116:1158:85). Además, se ha sugerido que la taurina probablemente actuando sobre el cerebro en desarrollo en la etapa fetal tiene efectos duraderos sobre el comportamiento en ratas. Hasta el momento no sé sabe cómo la suplementación con taurina podría afectar el eje GH-IGF-I, en este modelo de crecimiento retrasado al nacimiento, ni el contenido de VEGF en hipófisis. Objetivos: a) Estudiar el efecto de la suplementación de una dieta baja en proteínas administrada a ratas durante la preñez sobre la secreción de GH, gonadotrofinas, IGF I,  prolactina y VEGF en hipófisis y en suero de ratas en gestación (21.5 días de gestación), y de 12, 14 y 30 días de edad.  Las muestras serán preparadas en Canadá y procesadas en el IBYME, Buenos Aires.  En LHRI aplicaremos real time PCR para cuantificar los RNAm de VEGF y FGF en este modelo experimental, y siguiendo con nuestro proyecto PICT 2003, en hipófisis de ratones knockout para el receptor D2 (Ver sección 2.2).                 b) Medir los niveles de taurina por HPLC de los tratamientos aplicados, para determinar la correlación de sus niveles con las acciones descriptas a nivel pancreático, y las posibles acciones a nivel hipofisario. B) Por otro lado en el IBYME el grupo de la Dra. Becu y la Dra. Lux  han trabajado en los efectos de GABA actuando sobre sus receptores A, B y C a nivel hipofisario (Neuroendocrinology 73:334:01; Life Sci 58:1059:96). El GABA está además presente en el páncreas en altas concentraciones, como también la GAD, su enzima biosintética. Se han detectado receptores GABA A y GABA B en páncreas lo que sugiere que tendría un rol putativo como una molécula de señalización paracrina de los islotes (J Gen Physiol 123:185:04). Resultados previos han sugerido que GABA podría inhibir la secreción de glucagon actuando sobre receptores GABA A (Nature 341:233:89), y recientemente se ha demostrado que los receptores GABA B inhiben la secreción de insulina de los islotes pancreáticos de rata (J Physiol 559:397:04).  El grupo de la Dra. Lux ha comenzado a investigar las alteraciones endocrinas de ratones con disrupción del receptor GABA B (por knockout de la subunidad R1 del Receptor GABA B). Estos animales presentan epilepsia, hiperalgesia y alteraciones de la memoria (Neuron 31:47:01).  Resultados preliminares mostraron que los machos knockout tienen un aumento del tamaño de los islotes, del número y del contenido de insulina con respecto a los animales wildtype. De gran interés para ambos grupos resultará el estudio conjunto de la regulación de la función del páncreas y de la hipófisis en estos animales transgénicos. En este contexto los Objetivos particulares serán: -          La determinación de la expresión en páncreas de marcadores de proliferación o apoptosis, de células precursoras, o marcadores de diferenciación (nestin, CD34 o c-Kit (Endocrinology 145:3004:04), mediciones que se harán en el LHRI que ya tiene la metodología funcionando. En el IBYME se determinará la secreción de insulina y los niveles de GABA, sus enzimas de síntesis y sus receptores en  páncreas e hipófisis de animales de ambos genotipos. 2.2 Justificación (Incluir en no más de una página un resumen del proyecto CONICET o ANPCYT en ejecución y una descripción del impacto que las actividades de cooperación propuestas generarán en relación con el mencionado proyecto y con las actividades de los restantes grupos de investigación que integran la solicitud. Justificar la importancia complementaria que la actividad de cooperación tiene sobre los resultados esperados). Resumen PICT 2003- Nro 05-13666 El proyecto tiene como objetivo estudiar del desarrollo de la hiperplasia hipofisaria y del retardo del crecimiento asociados a la disrupción del gen que codifica para el receptor dopaminérgico D2 (RD2). En neuroendocrinología es bien conocido que el neurotransmisor dopamina, actuando sobre su RD2 hipofisario, inhibe la proliferación y función de los lactotropos, e inhibe la secreción de αMSH de los melanotropos. Sin embargo el papel que cumple este receptor en la diferenciación, proliferación y función de somatotropos es escasamente conocida. Recientemente describimos que la ausencia del D2R causa profundas alteraciones en la población somatotropa del ratón macho, y un fenotipo de crecimiento retardado (Endocrinology 143:1270:02). Por lo tanto el ratón knockout para el RD2 nos provee una herramienta importante para el estudio de la hiperplasia lactotropa y prolactinomas, línea de investigación histórica en nuestro laboratorio, así como para el estudio de la regulación del eje GHRH-GH en relación con el sistema dopaminérgico. En este contexto el proyecto consta de dos partes bien definidas, e interrelacionadas entre sí: a)  el estudio de la génesis de hiperplasia hipofisaria en ratones knockout para el RD2, y su comparación con otros modelos de hiperplasia hipofisaria (la rata hembra Sprague Dawley tratada con estrógenos, y la rata senil), y b) retardo de crecimiento: evaluación del eje GHRH-GH, y de componentes del balance energético relacionados a αMSH en ratones knockout para el RD2.  Los objetivos específicos son: 1) Estudiar la participación del producto del gen transformante tumoral hipofisario (PTTG), el VEGF, la Angiotensina II y el factor de crecimiento fibroblástico en la hiperplasia hipofisaria en el ratón hembra D2R-/- de dos backgrounds genéticos distintos (C57 y CF1). 2) Correlacionar los hallazgos encontrados en el punto anterior con otros modelos de hiperplasia hipofisaria: la rata hembra senil y la rata hembra adulta tratada con estrógenos 3) Analizar la respuesta de GH a dopamina, sus agonistas y antagonistas (de tipo 1 y 2), somatostatina, GHRH y Ghrelina en cultivos celulares adenohipofisarios en monocapa Comparar la respuesta en 4 grupos: ratones macho neonatos y  adultos (wildtype y knockout).  4) Analizar  la expresión del receptor de GHRH y de somatostatina (ST2 y ST5) en hipófisis de ratones wildtype y knockout. 5) Determinar el efecto de dopamina, sus agonistas y antagonistas, sobre la liberación de GHRH hipotalámica en forma comparativa en machos neonatos wildtype y knockout. 6) Determinar la expresión del receptor de αMSH (MC4) hipotalámico, y de sus agonistas y antagonistas comparativamente entre genotipos. Importancia complementaria de la actividad de cooperación -        Como mencionáramos en el punto anterior (2.1) el grupo canadiense tiene mucha experiencia en la participación de VEGF en distintas patologías. Sin embargo nunca han incursionado en la participación de VEGF en las patologías hipofisarias. Durante nuestra primer estadía en el LHRI realizaremos las real time PCR para el mRNA de VEGF y PTTG y las inmunohistoquímicas para VEGF y FGF de muestras experimentales obtenidas en Buenos Aires, en particular en relación con los puntos 1) y 2) del proyecto PICT 2003. -          Por otro lado la contraparte canadiense no tiene gran experiencia en neuroendocrinología y diferenciación sexual, y traerá las muestras de sus experimentos de desnutrición, alteración del crecimiento y suplementación con taurina para realizar en el IBYME las mediciones hormonales. Nosotros hemos trabajado en alteraciones del crecimiento (Endocrinology 143:1270:02) y el modelo experimental de desnutrición proteica y suplementación con taurina nos provee de un modelo adicional para investigar el componente endocrino del retardo de crecimiento lo que resulta de interés para ambas partes. -          Asimismo la contraparte canadiense nos enviará muestras de sangre para dosar los niveles de taurina luego de los tratamientos. El dosaje se hará por HPLC bajo la supervisión de la Dra. Lux (la metodología ya está puesta a punto) -          Con relación al proyecto de función del sistema GABAérgico en el páncreas endocrino, en la estadía de la Dra. Lux en el LHRI se determinará la expresión de marcadores de proliferación o apoptosis, de células precursoras, o mediadoras de diferenciación (nestin, CD34 o c-Kit (Endocrinology 145:3004:04), y en el IBYME se determinará la secreción de insulina y los niveles de GABA, sus enzimas de síntesis y sus receptores en páncreas e hipófisis de animales de ambos genotipos. -          Es de hacer constar que la vasta trayectoria en páncreas y diabetes, y la metodología que manejan los investigadores del LHRI, será fundamental para el desarrollo de los experimentos. -          Finalmente el proyecto de la Dra. Barañao relacionado con la función del VEGF en endometriosis se verá potenciado por las actividades de cooperación. Apuntamos a evaluar y comparar la acción de VEGF en tres tejidos endocrinos: hipófisis, páncreas y endometrio. Por otro lado se invitará a los investigadores visitantes a dar conferencias en distintos centros, y en lo posible se los ha invitado a concurrir en Noviembre para que sean conferencistas en los Congresos anuales biomédicos (SAFE; SAIC, SAEM) que siempre tienen lugar en ese mes.