Rol de AQP2 y TRPV4 en la activación y modulación de señales de Ca2+ en células renales

PIZZONI A; LOPEZ-GONZALEZ M; DI GIUSTO G; RIVAROLA V; CAPURRO C; FORD P

La Plata

Congreso; Congreso Sociedad Argentina de Fisiología 2016; 2016

Sociedad Argentina de Fisiología

La entrada de Ca desde el medio extracelular es esencial para la activación de diversas funciones celulares. SOCE (del ingles ?Store Operated CalciumEntry?) es un importante mecanismo para el ingreso de 2+ 2+ Ca regulado por el nivel de Ca en los depósitos intracelulares. Los recientes descubrimientos enrelación con SOCE han abierto nuevos caminos en la investigación de como este catión dirige el destino 2+ celular. La entrada selectiva de Ca esta mediada porla interacción de dos moléculas STIM1 y ORAI1. STIM1 2+ es un sensor de Ca en el retículo endoplasmático y ORAI1 es un canal en la membrana por el cual ingresa2+ Ca para rellenar los depósitos. También se han descripto a TRPC1 como componente clave en la 2+ entrada de Ca . El rol de otros TRPs como el canal de2+ Ca TRPV4 (Transient Receptor Potential Vanilloid 4) en SOCE es aún controvertido (Ma y col., 2011; Lorenzo y col., 2008). Recientemente se ha descripto que existe un complejo TRPV4-STIM1 que modifica la localización de TRPV4 en membrana (Shin y col., 2015). Un trabajo previo de nuestro laboratorio demostró que, en células renales, la activación y localización del TRPV4 es modulada por el canal de agua AQP2 (Acuaporina 2) en condiciones de hipotonía. Este mecanismo juega un rol fundamental en la regulación del volumen celular(Galizia y col., 2012). Otros autores encontraron que TRPV4 interacciona con AQP4 y AQP5 modulando el volumen celular en distintos sistemas (Liu y col., 2006; Benfenati y col., 2011, Jo y col. 2015). El objetivo del presente trabajo fue estudiar, en células renales, las consecuencias de la interacción TRPV4-AQP2 sobre SOCE en condiciones de isoosmolaridad. Utilizamos como modelo dos líneas celulares que derivan de túbulo colector de rata; una que no expresa AQP2 (WT RCCD1) y otra, transfectada en forma estable con cDNA de AQP2 (AQP2-RCCD1) Capurro y col., 2001; Ford y col., 2005). Utilizando un protocolo clasico paracuantificar SOCE evaluamos mediante la técnica de microscopia de fluorescencia los cambios en los niveles 2+ intracelulares de Ca [Ca ] y en el potencial de imembrana (Vm) utilizando FURA2-AM y DIBAC (3) 4 respectivamente. Encontramos que, al activar el TRPV4 con un activador especifico (4a-PDD, 10 mM) SOCE fuemayor en las células que expresan AQP2 respecto de las WT (Figura 1, A y B). La incubación con un inhibidor de SOCE (SKF-96365, 20 mM) anuló las diferenciasencontradas al activar TRPV4 (Figura 1C). Dado que SOCE es un mecanismo altamente sensible a alteraciones del Vm (Bird y col., 2008) estudiamos siactivar TRPV4 durante SOCE modificaba el Vm. Encontramos que las diferencias observadas en SOCE correlacionan con cambios opuestos en el Vm al activarel TRPV4. Las células que expresan AQP2 se hiperpolarizan y las células WT se despolarizan (Figura 2+ 1D). Se ha descripto que la entrada de Ca a través de+ 2+ TRPV4, puede activar canales de K sensibles a Ca (K ). La activación de TRPV4 entonces, puede producir Ca una hiperpolarización (Arnhold y col., 2007; Sonkusare y col., 2012; Berrout y col., 2014) o una despolarización (Konno y col., 2012) en función de diferencias en la Ca expresión de canales TRPV4 y K . Recientemente se ha descripto en túbulo colector de ratón, que la activaciónde TRPV4 gatilla canales SK3 (un subtipo de K ) Ca produciendo una hiperpolarización del Vm (Berrout y col 2014). Teniendo en cuenta estos hallazgos, probamos el efecto de la apamina (300 nM), un inhibidor decanales SK, sobre la potenciación de SOCE por TRPV4 en células que expresan AQP2. La figura 1E muestra que la apamina disminuye el aumento de SOCEobservado en las células AQP2-RCCD1 y no tuvo consecuencias sobre SOCE en ausencia de activación de TRPV4. Nuestros resultados sugieren que TRPV4activa canales SK3 generando una hiperpolarización del Vm, que a su vez potencia a SOCE en forma AQP2 dependiente. Por otra parte, experimentos diseñadospara evaluar la acción de la fuerza impulsora sobre SOCE mostraron que ante una despolarización + (generada por un aumento del K extracelular) los 2+ niveles de [Ca ] disminuyen en celulas WT en forma insignificativamente mayor que en células que expresan -1 AQP2 (pendientes: WT =-0,021± 0,001 s vs. HK-1 AQP2HK=-0,003±0,001 s ; p