Caracterización del intercambiador Na+/H+ en una línea celular de túbulo Colector Cortical de rata.

FORD, PAULA; KIERBEL, ARLINET; RIVAROLA, VALERIA; CHARA, OSVALDO; PARISI, MARIO; CAPURRO, CLAUDIA

Tafi del Valle - Argentina

Congreso; XXX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2001

Sociedad Argentina de Biofísica

El túbulo colector cortical del riñón de mamíferos juega un rol importante en la regulación del transporte de fluido y la homeostasis del equilibrio ácido base. Esta porción del nefrón presenta una heterogeneidad tanto estructural como funcional dado que existen al menos dos tipos celulares, las células intercalares y las células principales. Las células principales regulan la absorción de Na+ y la secreción de K+ y modulan la reabsorción de agua inducida por la hormona arginina-vasopresina (AVP). Las células intercalares estarían involucradas en la regulación del equilibrio ácido-base. Varios mecanismos responsables de la salida de ácido han sido descriptos en el túbulo colector como ser el intercambiador Na+/H+, las bombas de H+ y el cotransportador Na+/HCO3-. En lo que respecta al intercambiador Na+/H+ se han descripto varias isoformas (NHEs) en el riñón pero no es claro cual de ellas se expresa en el túbulo colector cortical y cual es su función. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la expresión funcional y molecular de las isoformas involucradas en la regulación del pH intracelular (pHi) en una línea celular derivada de túbulo colector cortical de rata (RCCD1). Las células fueron cultivadas sobre soportes permeables, cargadas con 2’,7’bis (2-carboxyethyl)-5-(and–6)carboxyfluorescein (BCECF/AM) y colocadas en una cámara que permite el acceso independiente al lado apical y basolateral. La cámara se coloca luego en una cubeta para la medición espectrofluorométrica. Nuestros estudios de medición del pHi mostraron que las células RCCD1 poseen una alta capacidad de regular espontáneamente el pHi luego de una carga ácida inducida por un pulso de amonio (D pH/min: 0.29 ± 0.02). Esta regulación es dependiente de la presencia de Na+ basolateral e inhibible en un 90 % por EIPA (100m M) y amiloride (100m M). Por otro lado estudiamos la activación del intercambiador Na+/H+ ante la exposición de las células a un gradiente osmótico. Cuando el gradiente se indujo con 100 mM de manitol se produjo una alcalinización (D pHi: 0.270 ± 0.051, n=4) sensible a amiloride, por el contrario no se observó esta respuesta cuando la hiperosmolaridad se indujo con urea (D pHi: 0.006 ± 0.026, n=4) indicando que la tonicidad sería importante para la activación del intercambiador Na+/H+. Además observamos que si el manitol se agregaba solo del lado basolateral ocurría una alcalinización inmediata (D pHi/min: 0.130 ± 0.020, n=4) por el contrario, el agregado de manitol del lado apical indujo apenas una lenta y leve alcalinización (D pHi/min: 0.043 ± 0.020, n=4). Estudiamos también el posible efecto de la AVP (10-8M) sobre el pHi basal. Nuestros resultados mostraron que la hormona indujo un aumento del pHi el cual no se produjo en presencia de amiloride (1000 m M). Tanto la respuesta a la hiperosmolaridad como la respuesta a la AVP indican que el Na+/H+ estaría involucrado en el mecanismo de regulación del volumen celular. Para determinar que isoformas estaban presentes en RCCD1 utilizamos las técnicas de RT-PCR y Western-blot. Encontramos que las isoformas involucradas eran la NHE-1 y la NHE-2. Como conclusión de este estudio podemos decir que en las células RCCD1 las isoformas NHE-1 y NHE-2 estarían ubicadas en la membrana basolateral, serían los principales reguladoras del pHi ante una carga ácida y probablemente estarían involucradas en la regulación del volumen celular. Entender estos mecanismos es de fundamental importancia ya que las células de los túbulos colectores se encuentran expuestas a variaciones de la osmolaridad extracelular. no se observó esta respuesta cuando la hiperosmolaridad se indujo con urea (D pHi: 0.006 ± 0.026, n=4) indicando que la tonicidad sería importante para la activación del intercambiador Na+/H+. Además observamos que si el manitol se agregaba solo del lado basolateral ocurría una alcalinización inmediata (D pHi/min: 0.130 ± 0.020, n=4) por el contrario, el agregado de manitol del lado apical indujo apenas una lenta y leve alcalinización (D pHi/min: 0.043 ± 0.020, n=4). Estudiamos también el posible efecto de la AVP (10-8M) sobre el pHi basal. Nuestros resultados mostraron que la hormona indujo un aumento del pHi el cual no se produjo en presencia de amiloride (1000 m M). Tanto la respuesta a la hiperosmolaridad como la respuesta a la AVP indican que el Na+/H+ estaría involucrado en el mecanismo de regulación del volumen celular. Para determinar que isoformas estaban presentes en RCCD1 utilizamos las técnicas de RT-PCR y Western-blot. Encontramos que las isoformas involucradas eran la NHE-1 y la NHE-2. Como conclusión de este estudio podemos decir que en las células RCCD1 las isoformas NHE-1 y NHE-2 estarían ubicadas en la membrana basolateral, serían los principales reguladoras del pHi ante una carga ácida y probablemente estarían involucradas en la regulación del volumen celular. Entender estos mecanismos es de fundamental importancia ya que las células de los túbulos colectores se encuentran expuestas a variaciones de la osmolaridad extracelular.