Genes de virus de interés veterinario y el estudio de su implicancia en la respuesta a proteínas desplegadas

COLINA S; ASPITIA C; NOGUEIRAS J; TIZZANO M; SERENA M. S; ECHEVERRIA M. G; METZ G

La Plata

Jornada; Primera Jornada Nacional de Articulación en docencia, investigación, extensión y servicio de las Carreras de Microbiología; 2021

Sede organizadora Facultad de Ciencias Veterinarias -UNLP y Facultad de Ciencias Exactas, Físco-química y Naturales- UNRC

El estrés de retículo endoplásmico se produce por la acumulación de proteínas desplegadas dentro de esta organela, lo que desencadena la activación de la respuesta ante proteínas desplegadas o UPR, en la que intervienen proteínas de membrana específicas como PERK, IRE1, ATF6 y Caspasa-12, las cuales inician vías de señalización que tienen como fin restablecer la homeostasis o iniciar la apoptosis celular1. Los virus han desarrollado diversas estrategias para controlar la UPR y así asegurar su progenie2. El siguiente trabajo busca estudiar la activación de la UPR empleando modelos virales de interés veterinario con genomas ARN como el virus de arteritis equina (VAE) y el distemper canino (VDC), al igual que con transfecciones con genes seleccionados de cada uno de los modelos.Para la obtención de cada uno de los genes virales, se diseñaron primers específicos con sitios de corte para enzimas de restricción (ER) seleccionadas, poniendo a punto para cada caso, los tiempos y temperatura en cada ronda de PCR. Para las construcciones recombinantes se utilizaron vector de clonado pGEM-T-Easy y vector de expresión pCDNA3-EGFP, junto con bacterias Escherichia coli JM109 y ER en base a los primers diseñados.Fueron seleccionados y amplificados los genes gp2b y np3 del VAE y v del VDC. Los primers para el gp2b y nsp3 fueron diseñados con los sitios de restricción de las ER HindIII y XhoI, mientras que para los oligonucleótidos del gen v, debido a la imposibilidad de usar las mismas ER, se decidió diseñarlos con los sitios de las EcoRV y NotI. Tras la digestión de insertos y vectores, se procedió a la ligación y posterior transformación de bacterias competentes. Los productos del VAE fueron ligados primeramente al vector de clonado y en un segundo paso, al vector de expresión. En el caso del amplificado del VDC, se decidió ligarlo directamente al vector de expresión.Hasta el momento se obtuvieron las construcciones para los genes de las proteínas virales GP2B, NSP3 y V. La construcción con el gen gp2b se encuentra lista para su secuenciamiento, mientras que para las construcciones de los genes nsp3 y v se está trabajando en las transformaciones. A futuro cercano, está planteado realizar transfecciones de líneas celulares para estudiar la activación de las diferentes vías de la UPR y así ensayar la posibilidad de inhibición de las mismas como forma de contener la replicación viral in vitro.