Determinación de aminoácidos libres por Cromatografía Líquida de Ultra Alta Resolución

ROXANA GONZALEZ; PAMELA Y. QUINTAS; RODOLFO G. WUILLOUD

Congreso; XI Congreso Argentino de Química Analítica; 2021

En los últimos años, la aplicación de procedimientos de derivatización pre-columna seguidos de separación por cromatografía líquida ha sido el enfoque analítico más conveniente y generalizado debido a su versatilidad, eficiencia y ensibilidad en el análisis de aminoácidos (AAs). Varios reactivos de derivatización se han propuesto para este propósito: isotiocianato de fenilo, o-ftalaldehído, cloruro de 1-dimetilaminonaftaleno-5-sulfonil y el cloruro de 9-fluorenil-metoxicarbonilo (FMOC-Cl). Este último, tiene la ventaja de reaccionar rápidamente tanto con grupos amino primarios como secundarios de los AAs para formar los carbamatos correspondientes altamente fluorescentes y estables. La detección de estos derivados (FMOC-AAs) se puede lograr mediante absorbancia UV o fluorescencia. Con esto en mente, el objetivo principal del siguiente trabajo fue desarrollar un método analítico para lograr la separación y detección de los AAs mediante RP-UHPLC-DAD (cromatografía liquida de ultra alta resolución en fase reversa acoplada a detector de arreglo de diodos), previa derivatización pre-columna utilizando FMOC-Cl. Para ello, primeramente, se estudió la influencia de diferentes variables experimentales del sistema cromatográfico, así como también, de la reacción de derivatización.Los AAs fueron derivatizados siguiendo el protocolo diseñado por Jámbor y Molnár-Perl (2009)1 con algunas modificaciones. En la reacción de derivatización se evaluó la concentración de concentración FMOC-Cl y su relación con los AAs. Los derivados formados en esta reacción fueron luego cuantificados mediante UHPLC-DAD3. La columna utilizada fue Shimadzu-C18 (2.2 mm d.i. x 7.5 cm, 3 μm). En la separación cromatográfica se estudió: pH, concentración de solvente orgánico y temperatura. Se trabajó con un flujo de 0.40 mL/min en modo gradiente entre solvente A (ácido trifluoroacético, 0,01 % v/v) y solvente B (acetonitrilo). La temperatura de trabajo fue 40°C. Las longitudes de onda de trabajo fueron:254 nm, 262 nm y 265 nm.La optimización de la metodología propuesta para la detección y cuantificación de AAs permitirá su análisis en diferentes matrices vegetales. Por sus efectos benéficos en la salud, las hortalizas han adquirido en los últimos años, y se prevee que continuarán haciéndolo en el futuro, mayor importancia como componentes de la dieta diaria. Como estimulantes naturales del crecimiento de las plantas, los AAs; entre ellos, metionina, prolina, trionina y glicina, se utilizan ampliamente para mejorar la disponibilidad de los nutrientes, el rendimiento y la calidad de las hortalizas