Inmovilización de la enzima de hiosciamina 6β-hidroxilasa a hidrogeles de quitina para su reutilización en la producción de anisodamina y escopolamina

JUAN MAURICIO MINOIA; MARÍA EMILIA VILLANUEVA; COPELLO, G; J. RODRIGUEZ TALOU; CARDILLO, A

Simposio; XIII Simposio REDBIO Argentina 2021; 2021

La enzima hiosciamina 6β-hidroxilasa (H6H) es el catalizador final de la rutabiosintética de escopolamina y se encuentra en diversas especies de pantas dela familia Solanacea. Tanto el sustrato de la enzima ?hiosciamina? como susproductos ?anisodamina y escopolamina? poseen propiedades farmacológicasy son utilizados como principios activos en diferentes fármacos. El método deproducción actual se basa en el cultivo de las plantas y su posterior extracción.Sin embargo, la planta no es capaz de producir anisodamina y escopolamina ?esta última de mayor valor comercial? en elevadas concentraciones aunencontrándose presente su precursor.En este trabajo se investiga la utilización in vitro de la H6H proveniente de la plantaBrugmansia candida fusionada a un dominio de afinidad a quitina (ChBD) einmovilizada en partículas de hidrogel de quitina con el objetivo de transformarhiosciamina en sus productos. Para ello, la construcción ChBD-H6H se clonó enel vector pET-22(b) y se expresó de forma recombinante en cepas de E.coliOrigami (DE3). Posteriormente, se evaluó la inmovilización y actividad enzimáticautilizando buffer Tris-ClH 50 mM pH 7,6 en dos condiciones de fuerza iónicadiferente, A=750 mM (n=3) y B=1 M NaCl (n=2). Cada inmovilización se llevó acabo por exposición de los extractos de proteína solubles clarificados con lasmatrices de quitina en una relación 1,5 ml volumen de matriz ? 3 mg proteínassolubles totales, evaluándose la unión específica de la enzima ChBD-H6Hmediante SDS-PAGE teñidos con azul brillante de Coomassie y Western-Blotcontra la proteína H6H. De forma seguida, las enzimas inmovilizadas fueronsometidas a cinco ciclos de reacción (24h/ciclo, 30°C, 200 rpm) y la conversión dehiosciamina fue evaluada mediante cromatografía líquida de alta performance. Elporcentaje de bioconversión a anisodamina comparando las condiciones A y B enlos ciclos de reacción 1 (75,9±3,6 vs 31,0 ±2,5) y 2 (53,7±2,0 vs 35,8±0,8) fuesignificativamente diferente (p