Aplicaciones de la genómica funcional en el descubrimiento e identificación de nuevos genes en girasol.

FERNANDEZ, P.; DI RIENZO, J.; PRÍNCIPI, D.; SORIA, M.; MOSCHEN, S.; DOSIO, G.A.A.; AGUIRREZÁBAL, L.A.; HOPP, H.E.; PANIEGO, N.; HEINZ, R.A.

Buenos Aires

Congreso; 5to Congreso Argentino de Girasol; 2010

Asociación Argentina de Girasol

Las micromatrices de alta densidad representan una herramienta clave para análisis transcripcionales concertados. Este trabajo tiene como objetivo central el diseño de una micromatriz de alta densidad para el girasol cultivado que represente todas las secuencias disponibles en GenBank/NCBI incluidas en las bases de datos de ESTs, con el propósito de ser utilizada en estudios de expresión génica asociados a respuestas de estrés biótico y abiótico. Este trabajo contempló la limpieza de secuencias contaminantes presentes en los ESTs y secuencias depositadas en bases de datos públicas, el ensamblado de ellos en genes únicos (unigenes) genuinos y representativos (eliminación de redundancias utilizando el paquete EMBOSS [1] y armado de contigs utilizando CAP3 [2]),así como también la inferencia de orientación de unigenes predichos a través del algoritmo BLASTX contra la base de datos de proteínas RefSeq [3] y la anotación funcional de los mismos según un vocabulario controlado que pueda asociar un UNIGEN a una función hipotética determinada, mediante el programa Blast2Go [4] Interpro [5] y KEGG [6]. Para el diseño de la micromatriz, se utilizó la aplicación eArray [7] con los siguientes parámetros de diseño: Largo de Sonda: 60bp, Sonda por Unigen: 1, Enmascarado de secuencias de vector, Orientación de la Sonda en Sentido, Opciones de diseño: Metodología de Sonda Óptima con sesgo en 3’, micromatriz en formato 4 x 44K. Se identificaron los unigenes a ser incluidos en el chip de girasol. Paralelamente se identificaron dentro del conjunto de unigenes, las variantes alélicas para el diseño de un panel de marcadores funcionales tipo SNPs para ensayos de genotipificación masiva según la técnica GoldenGate/Veracode, Illumina.  Un total de 28.089 singletons y 12.924 contigs fueron ensamblados, y aproximadamente 22.000 unigenes se anotaron con terminología GO [8] y mapeados metabólicamente por KEGG [6], demostrando que las principales vías metabólicas se encuentran representadas. El diseño de la micromatriz comprende un total de 45.220 sondas, con 1.417 controles y 43.003 sondas blanco. Con respecto a la detección de polimorfismos, se identificaron 1.441 SNPs en 695 contigs, donde 1.300 SNPs presentaron una puntuación de diseño ³ 1 de acuerdo con el programa Assay Design Tool (Illumina). Se seleccionaron, un total de 384 SNP que serán incluido en un panel de marcadores a ser analizados con la plataforma de genotipificación VeraCode (Illumina). Paralelamente se identificaron genes de referencia para girasol de expresión estable que están siendo utilizados en ensayos de validación de SAGs por qPCR, habiéndose validado hasta el presente tres genes SAGs de girasol ortólogos a genes de Arabidosis thaliana ( R2,proteína de unión a calcio; D3, enzima vacuolar hidrolítica; D4,proteasa cisteínica) [9].  La validación del chip se realizará en una primera instancia a través del estudio de genes candidatos (SAGs) asociados al proceso de senescencia. La incorporación de ensayos de micromatrices permitirá evaluar genotipos de tipo “Stay green” frente a genotipos control en condiciones que retardan (decapitado) y/o aceleran (estrés hídrico) la senescencia respecto a plantas control, ensayos que se están llevando a cabo en la Unidad Integrada EEA INTA Balcarce-UNMdP . La información de las clonotecas de ESTs, unigenes anotados funcionalmente, sondas de micromatriz y SNPs estarán disponibles a través de SfGD (Sunflower Genome Database), una base de datos relacional diseñada en MySQL, La síntesis del chip y el ensayo de Illumina Golden Gate se encuentran en proceso de validación como herramientas transcriptómicas para la evaluación de estreses bióticos y abióticos sobre diferentes accesiones de Helianthus annuus . La información de las clonotecas de ESTs, unigenes anotados funcionalmente, sondas de micromatriz y SNPs estarán disponibles a través de SfGD (Sunflower Genome Database), una base de datos relacional diseñada en MySQL, La síntesis del chip y el ensayo de Illumina Golden Gate se encuentran en proceso de validación como herramientas transcriptómicas para la evaluación de estreses bióticos y abióticos sobre diferentes accesiones de Helianthus annuus .