Caracterización de plantas transgénicas de papa resistentes a PLRV y PVY

ALMASIA N I; NAHIRÑAK V; AGUADO G; MASUELLI R; HOPP H E; VAZQUEZ ROVERE C

Mar del Plata

Congreso; XXIII Congreso de la Asociación Latinoamericana de la Papa; 2008

Introducción: Nuestro grupo ha obtenido y caracterizado plantas transgénicas de papa que expresan el ORF 2b de la replicasa de PLRV que presentaron resistencia a la infección viral (denominadas líneas LR). Asimismo hemos demostrado que esta resistencia está mediada por RNA y que el silenciamiento post-transcripcional está involucrado en el mecanismo de resistencia (Vazquez Rovere et al., 2001a). Por otro lado, el descubrimiento de supresores de silenciamiento presentes en casi todas las familias virales (Voinnet et al., 1999) y el hecho de que la supresión del silenciamiento no sea específica para un determinado transgen plantean el desafío biotecnológico de obtener líneas transgénicas resistentes a diferentes virus que puedan coexistir en el campo. Con este objetivo hemos obtenido líneas transgénicas que coexpresan el gen de la replicasa de PLRV y la proteína de cápside (CP) del virus del mosaico de lechuga (LMV). Esta última confiere resistencia heteróloga al virus Y de la papa (PVY) aunque se desconoce el mecanismo por el cuál la CP otorga dicha resistencia (Dinant et., 1998). En un ensayo de desafío en condiciones controladas de invernadero se hallaron líneas que exhibieron inmunidad a PLRV, líneas que mostraron ausencia de infección con PVY y líneas que presentaron inmunidad a ambos virus (líneas RY) (Vazquez Rovere et al., 2001b). En este trabajo se presentan los resultados de los análisis moleculares y fenotípicos realizados con el fin de caracterizar las líneas transgénicas (líneas LR y RY) y el mecanismo de resistencia que opera en las mismas. Materiales y métodos: La cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 pAL4404 transformada con el plásmido pZPKan-LMV-REP (Vazquez Rovere et al., 2001b) fue utilizada en los ensayos de transformación de papa. Transformación de hojas de papa via Agrobacterium Se utilizaron como explantos discos de hoja de Solanum tuberosum cv. Kennebec siguiendo el protocolo descripto por Vazquez Rovere et al., 2001a. Las plantas se mantuvieron periódicamente por micropropagación en medio MS. Caracterización molecular de las líneas transgénicas Las extracciones de RNA de las plantas seleccionadas se realizaron utilizando las columnas RNeasy Plant kit (Qiagen). Los ensayos de Northern blot y Western blot se realizaron según describe Sambrook y col., en 1989. Se utilizó el anticuerpo anti-LMV conjugado a fosfatasa alcalina que comercializa Bioreba en los ensayos de Western blot. Ensayos de infección con PVY Diez plantas de las líneas pre-seleccionadas (líneas LR1 a 6 y líneas RY1 a 6) fueron transplantadas y 10 días después inoculadas con PVY utilizando carborundum. Plantas no transformadas fueron utilizadas como control. Se realizaron ensayos de DAS-ELISA (Bioreba) para confirmar la infección según las recomendaciones del fabricante. Resultados y discusión: Se ha descripto que la expresión de la CP de LMV es imprescindible en las plantas transgénicas que presentan resistencia a PVY (Dinant et., 1998), con el fin de caracterizar las líneas transgénicas obtenidas en este trabajo, se realizaron ensayos de Western blot que mostraron que las líneas RY pre-seleccionadas expresan niveles detectables de CP. Asimismo, con el fin de realizar un estudio comparativo de expresión del ORF2b de PLRV se infectaron mecánicamente las líneas transgénicas con un inóculo de PVY y se realizaron ensayos de Northern blot en las dos condiciones (sin infectar e infectadas con PVY). Los resultados de ELISA mostraron que sólo las líneas RY resistieron la inoculación con PVY presentando valores comparables con los de las plantas controles sin inocular. La expresión del ORF2b sólo fue detectada en las líneas LR pero únicamente luego de ser infectada con PVY. Estos resultados sugieren que la resistencia a PLRV por silenciamiento post-transcripcional del ORF2b descripta en dichas líneas LR puede ser potencialmente superada si éstas se infectan previamente con PVY. Asimismo, estos resultados corroboran la importancia de obtener líneas transgénicas resistentes a diferentes virus que puedan naturalmente coexistir en el campo. Con el objetivo final de profundizar en la caracterización del mecanismo de resistencia de dichas plantas en condiciones naturales de infección a campo, se realizó un ensayo de multiplicación y obtención de minitubérculos de las líneas pre-seleccionadas. Plantines de 6 líneas LR y 6 líneas RY se sembraron en la localidad de Malargüe, como así también plantines de los controles (plantas transformadas con el vector vacío o plantas sin transformar). El ensayo se realizó bajo normas y aprobación de la CONABIA dependiente de la SAGPyA. Al finalizar el ensayo se descartaron 3 líneas LR y 1 línea RY luego de su evaluación, considerando la performance agronómica y la preservación de la identidad del cultivar (crecimiento, vigor, rendimiento). Actualmente se está llevando a cabo un ensayo de multiplicación y obtención de tubérculos (Exp.CONABIA S01:45507/07) partiendo de los minitubérculos cosechados de los eventos seleccionados. La evaluación de la resistencia a PLRV y/o PVY en condiciones naturales de infección a campo se realizará en una tercera etapa sobre las plantas brotadas de los tubérculos obtenidos de este segundo ensayo y de esta manera minimizar los posibles errores en la caracterización que pueden ocurrir cuando se evalúan plantas que recién han pasado por cultivo de tejidos.