Análisis de perfiles transcriptómicos en plantas de papa transgénicas que sobreexpresan el péptido antimicrobiano snakin-1 (SN1)

NAHIRÑAK V; ALMASIA NI; HOPP H E; DI RIENZO J; VAZQUEZ-ROVERE C

Mar del Plata

Congreso; XXIII Congreso de la Asociación Latinoamericana de la Papa; 2008

Introducción El péptido Snakin-1 ha sido aislado de tubérculos de plantas de papa (Solanum tuberosum cv. Desireé) y ha sido clasificado dentro de una nueva familia: snakin/GASA [11, 4]. Se ha demostrado que SN1 presenta actividad in vitro aún en concentraciones menores a 10 micromolar, frente a patógenos fúngicos y bacterianos [11, 4]. El rol en defensa propuesto no es incompatible con la posibilidad de que este péptido esté involucrado también en otros procesos y funciones biológicas. La secuencia aminoacídica de SN1 comparte homología con genes de Solanum licopersicum, Arabidopsis y Ricinus communis, entre otros. Además de formar parte de mecanismos de defensa, miembros de esta familia han sido reportados como involucrados en la regulación de la elongación celular, división celular, estimulación o inhibición de la elongación del tallo y la corola [2, 9, 5, 6, 10]. Recientemente, con el objetivo de explorar la función biológica de SN1, nuestro grupo obtuvo y caracterizó molecularmente líneas transgénicas del cultivar comercial de papa Kennebec. Mediante ensayos de desafío, demostró que sólo las líneas que sobreexpresan el gen SN1 presentan resistencia a enfermedades provocadas por patógenos de gran importancia comercial como Rhizoctonia solani y Erwinia carotovora [1]. Si bien no se han observado diferencias fenotípicas a nivel macroscópico entre las plantas transgénicas de papa obtenidas en el laboratorio y las no transgénicas en las condiciones ensayadas [1], es posible que exista una expresión diferencial de genes que explique el nivel y tipo de resistencia alcanzada pero que no implique cambios fenotípicos evidentes. El estudio de los perfiles transcriptómicos de las plantas de papa transgénicas que sobreexpresan el gen SN1 se utilizó como herramienta para identificar genes que puedan estar afectados y esclarecer el mecanismo de resistencia observado que opera en las mismas. Materiales y Métodos Se crecieron 6 plantas de cada línea transgénica que sobreexpresa el gen SN1 (líneas S1 y S3) como así también 6 plantas no transgénicas (control) en macetas de 5lts en condiciones controladas de temperatura (22°C) y humedad (70%). Se realizaron extracciones individuales de RNA a partir de 100 mg de hojas de las plantas mencionadas utilizando las columnas RNeasy Plant kit (Qiagen). Se determinó la calidad del RNA mediante electroforesis en gel de agarosa, posteriormente las muestras fueron valoradas en el analizador de moléculas Bioanalyzer 2100 (Agilent) y cuantificadas con un espectrofotómetro ND 1000 NanoDrop. Se utilizó un microarreglo de RNA con tecnología Affymetrix desarrollado con cDNAs de tomate (GeneChip- Tomato Genome Array). Se realizaron 2 réplicas biológicas (pool de 3 plantas) y 2 réplicas técnicas en cada caso. Las hibridaciones y obtención de los valores de intensidad correspondientes se realizaron utilizando el servicio del IFEVA. La matriz de expresión génica se generó mediante el procedimiento ?rma? [7, 8] implementada en el paquete ?affy? de la plataforma R. El procesamiento se realizó utilizando InfoStat (2008). En primer lugar se eliminaron los genes con poca relevancia en la separación de los tratamientos. Para ello se ajustó un modelo lineal (ANOVA) utilizando el procedimiento lmFit (limma), se calcularon los p-valores a partir de la estimación del error estándar de los contrastes mediante un método Bayesiano empírico [12] utilizando el procedimiento ebayes (limma). Se retuvieron los genes con p-valores menores a 0.10 y a los genes retenidos se les aplicó una corrección del p-valor para controlar la tasa de descubrimientos falsos (FDR) aplicando el procedimiento de Benjamini y Hochberg [3]. Utilizando el nivel de significación usual del 5% se retuvieron 42 genes cuyos p-valores ajustados fueron menores que 0.05. Resultados y Discusión En ensayos previos de Northern blot y RT-PCR cuantitativa demostramos que las líneas S1 y S3 presentan los niveles mayores y menores de sobreexpresión del gen SN1 respectivamente, por lo que se decidió utilizar estas líneas para el análisis de los perfiles transcriptómicos. A partir de tejido de hojas de plantas de papa fue posible obtener RNA de muy buena calidad y en cantidad suficiente para ser utilizado en ensayos de microarreglos desarrollados con tecnología Affymetrix. El análisis de los perfiles transcriptómicos de las líneas transgénicas de papa que sobreexpresan snakin-1 (S1 y S3) y la línea sin transformar (control), permitió identificar 42 genes que presentaron diferencias significativas en cuanto a sus niveles de expresión. Existen dos grandes patrones de movimiento de genes. Uno de los grupos se encuentra sobreexpresado en la línea no transformada en relación a la línea S1 y luego recupera niveles de expresión similares al control en S3, mientras que el segundo grupo de genes tiene un comportamiento especular al primero. Mediante un análisis de componentes principales de la matriz de expresión génica (estandarizada) de los 42 genes seleccionados fue posible apreciar que la línea transformada S1 se aleja considerablemente de la línea S3 y de la no transformada. El primer eje principal acumula casi la totalidad de la información reteniendo el 93% de la variación total, el segundo solo el 5% y el tercero el 1%. Las diferencias de expresión de SN1 entre las dos líneas probablemente expliquen el alejamiento observado cuando se comparan los perfiles de expresión con respecto al control y la separación de la línea S3 en relación a la línea sin transformar no resulta tan evidente. El análisis de comparación de secuencias utilizando las bases de datos publicadas permitió establecer que la mayoría de los genes del primer grupo están asociados a la pared celular (tanto proteínas estructurales como enzimas con diferentes funciones), mientras que representantes interesantes del segundo grupo son proteínas relacionadas a stress como las heat-shock proteins. Se diseñaron oligonucleótidos específicos de los genes candidatos para validar su expresión diferencial mediante RT-PCR en tiempo real y/o ensayos de Northern-blot.