Caracterización de la actividad supresora del silenciamiento génico de la proteína P0 del aislamiento argentino del potato leafroll virus.

BARRIOS BARÓN, MARÍA P.; DELFOSSE, VERÓNICA C.; AGROFOGLIO, YAMILA C.; NAHIRÑAK, VANESA; ALMASIA, NATALIA I.; VAZQUEZ ROVERE, CECILIA; DISTÉFANO, ANA J.

C.A.B.A.

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

El Potato leafroll virus (PLRV), es la especie tipo del género Polerovirus de la familia Luteoviridae. Este virus se encuentra presente en todas las regiones paperas del mundo, y causa severas pérdidas en el rendimiento, pudiendo llegar a mermar hasta en un 90% la producción. En Argentina, junto al potato virus Y (PVY), es una de las virosis más frecuente. La actividad supresora de silenciamiento génico de la proteína P0 del PLRV ha sido caracterizada para varios aislamientos de diferentes regiones geográficas, observándose diferencias en su actividad. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la actividad supresora de la proteína P0 de un aislamiento argentino de PLRV (P0PLa) y determinar su mecanismo de acción. Para los ensayos de supresión del silenciamiento de RNA se utilizaron dos sistemas basados en el silenciamiento de la proteína GFP, que permiten describir el mecanismo de acción y la etapa en la vía del silenciamiento que estaría afectada por el supresor. Las hojas de plantas de Nicotiana benthamiana de la línea 16C (que expresa constitutivamente GFP) fueron coagroinfiltradas con una copia de GFP y la proteína P0PLa. Las regiones infiltradas se observaron de color verde fluorescente a los 5 días postinfiltración, indicando que P0PLa posee actividad de supresor de silenciamiento local. Además, P0PLa fue capaz de inhibir eficientemente el movimiento a larga distancia de la señal de silenciamiento, tal como se reportó para el aislamiento australiano de PLRV y diferente a lo reportado para el aislamiento europeo. Para estudiar si la proteína P0PLa suprime el silenciamiento de RNA disparado por secuencias de RNA doble cadena (dsRNA), se infiltraron hojas de N. benthamiana con la proteína P0PLa, GFP y el inductor de dsRNA GFFG que deriva del gen GFP, observando nuevamente un fenotipo de supresión de silenciamiento. Con el fin de identificar el nivel de la vía del silenciamiento en el que P0Pla actúa, se investigó su efecto en la producción de pequeños RNAs interferentes (siRNAs). Las hojas de N. benthamiana se coinfiltraron con una mezcla del inductor GFFG más P0Pla y controles de supresores con actividad conocida. No se detectaron siRNAs primarios, por lo que P0Pla interferiría con un paso de la vía del silenciamiento río arriba de la producción de siRNA, a nivel de las proteínas DICER LIKE.Por otro lado, según lo reportado para la proteína P0 del polerovirus turnip yellow virus, P0 interacciona, mediante su dominio F-Box, con el sistema SCF-ubiquitin ligase y media la degradación de la proteína AGO1 de la vía de silenciamiento de la planta via autofagia. Con el objetivo de determinar si el mecanismo de acción de P0PLa esta conservado, se evaluó mediante la técnica de doble hibrido en levaduras la interacción con las proteínas ASK de Arabidopsis thaliana y sus correspondientes ortólogos en Nicotiana benthamiana (SKP) y en su hospedador natural Solanum tuberosum (StSKP1).