Estudio funcional del promotor del gen snakin-1 de papa en el sistema modelo de Arabidopsis

ALMASIA N I; NAHIRÑAK V; HOPP H E ; VAZQUEZ ROVERE C

Mar del Plata

Congreso; XXIII Congreso de la Asociación Latinoamericana de la Papa; 2008

Introducción Snakin-1 (SN1) es un péptido antimicrobiano aislado de papa (Solamun tuberosum cv. Desireé), que presentó actividad in vitro e in vivo frente a patógenos fúngicos y bacterianos [14,1]. Es el péptido mayoritario de tubérculo y su expresión ha sido detectada mediante ensayos de “Northern Blot”, en tubérculos, vástagos, yemas axilares, y yemas florales jóvenes. Este patrón sugiere que es un componente importante de las defensas constitutivas de las plantas, fundamentalmente en órganos reproductivos y de almacenamiento [12]. La regulación de la expresión proteica en un tejido o tipo celular de un organismo, está determinado por la presencia de secuencias regulatorias en la región promotora de los genes y por su interacción con factores específicos. De acuerdo a su especificidad estos promotores se han clasificado en inducibles, constitutivos, específicos de tejido y/o de desarrollo. En papa se han hallado promotores tejido-específicos [13,4], constitutivos [2] e inducibles por azúcares [6], por heridas [8,15], por infecciones fúngicas [9] por estrés [7] o por frío [11] entre otros. Entender como es orquestada la regulación de genes es un desafío importante para caracterizar los complejos procesos biológicos [16]. Asimismo, como la aplicación de plantas genéticamente modificadas ha aumentado considerablemente, también lo ha hecho la necesidad de desarrollar métodos que permitan un “ajuste-fino” de la expresión de los transgenes de interés en respuesta directa a especificidades ambientales, fisiológicas y químicas [10,14]. Con el fin de determinar las secuencias regulatorias en cis responsables de la expresión del gen SN1 nuestro grupo amplificó una región correspondiente a 1421 pb río arriba del codón iniciador de la traducción del gen SN1 de Solanum tuberosum cv Kennebec. El estudio in silico de dicha región determinó que los principales sitios de unión de factores de transcripción están relacionados con: inducción de auxinas; expresión tejido-específica; senescencia; activación por luz azul, blanca o UV-A; respuesta a deshidratación, respuesta a cambios de temperatura y a etileno. En este trabajo presentamos la validación funcional de dichas secuencias en plantas transgénicas de Arabidopsis centrándonos en el estudio de la expresión tejido específica del promotor del gen SN1 en distintos estadios de desarrollo y su regulación frente a distintos estímulos bióticos y abióticos. Materiales y Métodos La secuencia de 1421 pb del promotor del gen SN1 de Solanum tuberosum cv Kennebec fue clonada en el plásmido pAKK río arriba del gen reportero que codifica para la enzima betaglucuronidasa y posteriormente el casete de expresión se subclonó en el vector binario pCAMBIA. Las construcciones controles consistieron en un vector binario carente de promotor o bien conteniendo el promotor 35S de CaMV. Para la transformación se emplearon plantas de Arabidopsis y una solución de Agrobacterium tumefaciens GV3101 transformada con los vectores binarios. La tinción histoquímica de la actividad GUS se realizó siguiendo el procedimiento descripto por Jefferson y col. [5] incubando los explantos a 37°C durante 16 hs y decolorándolos con lavados sucesivos de alcohol 70%. Los análisis cuantitativos de GUS se desarrollaron de acuerdo a Jefferson y col. [5], determinando la cuantificación de proteínas por Bradford [3] y calculando la actividad de GUS como nmoles de 4-Metilumbeliferona (4-MU) por hora por microgramo de proteína. Los tratamientos consistieron en regar plantas de 4 semanas con soluciones de hormonas o sólo con agua durante 6 horas o bien someter plantas a distintas temperaturas en oscuridad y humedad constante. Se realizaron al menos dos ensayos independientes y se llevaron a cabo los análisis estadísticos para determinar la significancia de los tratamientos. Resultados y Discusión A fin de estudiar in vivo la localización tisular dirigida por la región promotora del gen SN1 se obtuvieron 18 líneas homocigotas de Arabidopsis thaliana. Asimismo se lograron 7 líneas portadoras del promotor 35S y 4 portadoras del casete carente de secuencia regulatoria. La presencia del transgen fue confirmada mediante PCR en todas las líneas transgénicas. De las 18 líneas homocigotas del promotor de SN1 se seleccionaron cuatro, una de expresión tenue, una de expresión fuerte y dos de expresión intermedia. La proteína reportera se detectó principalmente en las nervaduras, en la raíz, en zonas meristemáticas, en vainas pero no en semillas y en componentes determinados de la flor (corola y/o gineceo) dependiendo del estadio del desarrollo. Asimismo se seleccionó una línea del promotor 35S que presentó tinción ubicua muy fuerte y una línea control negativa que no presentó tinción alguna. A fin de evaluar la expresión temporal de la proteína reportera se tomaron plantas de cada línea homocigota a lo largo de 6 semanas y se realizaron tinciones. Mediante este método colorimétrico fue posible detectar una intensa expresión de dicha proteína en las líneas transgénicas durante las primeras semanas en casi todas las hojas y flores aunque escasamente en el tallo floral. Sin embargo a medida que la planta crecía (hacia la sexta semana) las hojas casi no expresaban la proteína reportera, sólo las flores más jóvenes lo hacían mientras que no se observaba expresión en el tallo floral. Con el objetivo de evaluar si los sitios de reconocimiento de factores de transcripción determinados por el estudio in silico eran activos, en primer lugar se analizó la inducción por hormonas vegetales (ácido abscísico, ácido indol acético y ácido giberélico o bien sólo agua) y se evaluó la expresión por los métodos colorimétrico y fluorométrico. A pesar de la existencia de posibles sitios regulatorios en cis no hubo cambios significativos en el nivel de expresión de las plantas transgénicas en las condiciones ensayadas. Asimismo, mediante ensayos de RT-PCR se determinó que el tratamiento aplicado había sido efectivo al amplificar genes controles inducibles por dichas hormonas. Por otro lado, al analizar el efecto de la temperatura, todas las líneas que portaban el promotor de SN1 exhibieron una marcada inducción de la expresión de la proteína reportera a 4 °C y a 37 °C mientras que las líneas controles no presentaron cambios significativos. Finalmente, ensayos preliminares mostraron que el promotor de SN1 se induce en condiciones de luz y al sufrir heridas en el tejido. Estos resultados sugieren que la secuencia regulatoria aislada del gen SN1 de papa determina expresión génica temporal y espacial altamente específica en el sistema modelo de Arabidopsis, a su vez regulada en respuesta a las condiciones ambientales.