Producción de Factores de Crecimiento Recombinantes utilizando biorreactores vegetales

CAROLINA MÜLLER; MIRKIN, FEDERICO GABRIEL; CAROLINA PEREZ CASTRO; WIRTH, SONIA ALEJANDRA; MARÍA EUGENIA SEGRETIN

La Plata

Taller; Taller en Molecular Farming; 2019

Los factores de crecimiento son proteínas de señalización que regulan procesos de división ydiferenciación celular, y son necesarios para el mantenimiento in vitro de líneas celulares conpropiedades de células madre. El objetivo del presente trabajo es evaluar la producción defactores de crecimiento recombinantes en dos sistemas de expresión basados en biorreactoresvegetales: expresión estable en plantas transplastómicas de Nicotiana tabacum, y expresióntransitoria en Nicotiana benthamiana. En primer lugar, se evaluó la transformación del genomaplastídico para expresar el Factor de Crecimiento Fibroblástico (hbFGF); este sistema se eligiódebido a la potencialidad para alcanzar altos niveles de expresión de proteínas heterólogas. Lasecuencia codificante de hbFGF se clonó en un vector de transformación plastídica y setransformaron hojas de N. tabacum por biobalística. La naturaleza transplastómica de losbrotes regenerantes se analizó mediante PCR, corroborando la integración del transgén. Laslíneas obtenidas fueron sometidas a sucesivas rondas de regeneración para alcanzar lahomoplastia y posteriormente rusticadas. Mediante la técnica de western blot, fue posibledetectar la presencia de la proteína hbFGF en plantas de primera ronda de regeneraciónrusticadas. Por otro lado, se evaluó la expresión y acumulación de hbFGF en distintoscompartimentos subcelulares utilizando un sistema de expresión transitoria en N. benthamiana.Se adaptó el vector de expresión transitoria pEAQ para hacerlo compatible con el sistema declonado Golden Gate Assembly. El vector adaptado permite el clonado modular de proteínasrecombinantes fusionadas a diferentes señales de localización subcelular y fue utilizado paraclonar distintas versiones de hbFGF, dirigiendo su expresión a citoplasma, apoplasto, retículoendoplasmático y vacuola. Se agroinfiltraron plantas de N. benthamiana con las distintasconstrucciones y se evaluó la expresión de hbFGF por western blot, observándose expresiónde la proteína recombinante en apoplasto y en retículo endoplasmático. En conclusión, los dossistemas estudiados permiten expresar la proteína recombinante hbFGF. Una vez optimizadoslos niveles de expresión será posible determinar cuál es el sistema más adecuado para laproducción de esta proteína recombinante. A su vez, el sistema de expresión transitoria en N.benthamiana resulta versátil para el estudio de expresión de otros factores de crecimientorecombinantes.