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Introducción: Las adenilato quinasas (Adk) y las nucleósido difosfato quinasas (NdPk) son enzimas ampliamente distribuidas en los seres vivos. Las mismas son fosfotransferasas que catalizan la transferencia de fosfatos de alta energía entre los nucleótidos de adenosina manteniendo la homeostasis intracelular de los mismos y duplicando el potencial energético del ATP. Usualmente a estas enzimas se las encuentra asociadas a estructuras subcelulares dedicadas a la síntesis como al consumo de ATP. Entre estas últimas podemos destacar a los flagelos de cuya movilidad depende la supervivencia y viabilidad de numerosos organismos tanto de vida libre como parásitos incluyendo a T. cruzi. En tripanosomátidos se han encontrado siete isoformas de adenilato quinasa (TzAdk1-6 y N) y cuatro de nucleósido difosfato quinasa (TzNdPk1-4). Esto se podría explicar debido a la gran diversidad de condiciones que atraviesan durante su ciclo de vida. En el presente trabajo caracterizamos las fosfotransferasas flagelares TzAdk4 y TzNdPk3 de T. cruzi.Objetivos: caracterizar la Adenilato quinasa 4 y Nucleosido Difosfato 3 de T cruziMetodología:Cultivos de parásitos: Epimastigotes de Trypanosoma cruzi de la cepa CL Brener (salvajes o modificados genéticamente) se cultivan a 28°C en medio LIT (triptosa de infusión de hígado) suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino y estreptomicina/penicilina. En el caso de los parásitos transgénicos se mantendrán en las mismas condiciones con el agregado de 500 µg/ml de geneticina. Producción de anticuerpos específicos: se produjeron anticuerpos específicos contra la posible ADK 4 y la NDPK 3 Ratones de la cepa Balb/c son inyectados con la proteína recombinante de interés, una dosis cada 15 días, 3 dosis en total. Posteriormente se obtiene la sangre de los ratones, se la centrifuga y se recupera el suero. Este suero conteniendo anticuerpos específicos se utiliza luego en los ensayos de Western Blot y de inmunolocalización.Localización subcelular por inmunofluorescencia: Los parásitos se fijan con una solución de PBS-formaldehído y se los permeabiliza con tritón X100. Se los incuba primero con el anticuerpo contra la proteína de interés y luego con un anticuerpo secundario asociado a fluoróforos. La localización de la proteína se determina por fluorescencia observando mediante un microscopio Olympus BX51. Como marcadores de localización se utilizarán, colorante DAPI (nuclear) yPAR2 (flagelar)Estudios de expresión por Western Blot: Extractos proteicos de parásitos sometidos a distintos tratamientos son analizados para la expresión de las distintas fosfotransferasas los anticuerpos producidos y los protocolos clásicos de Western Blot.Construcción de parásitos transgénicos: Para la sobre-expresión de las proteínas de interés, se construirán modelos de parásitos transgénicos a partir de epimastigotes de la cepa CL Brener. Los parásitos se transfectarán, utilizando las técnicas clásicas, utilizando plásmidos completamente diseñados en nuestro laboratorio.Resultados y Conclusiones: TzAdk4 y TzNdPk3 fueron clonadas y sobre-expresadas en bacterias purificándose la proteína obtenida. Mediante ensayos bioquímicos de actividad enzimática, se pudo validar a las mismas como adenilato quinasas y nucleósido difosfato quinasas respectivamente. Con el objetivo de confirmar su localización subcelular se diseñaron plásmidos capaces de sobre expresar las distintas isoformas fusionadas a la proteína verde fluorescente. Una vez obtenido los parásitos transgénicos se pudieron observar patrones solubles como flagelares para ambas proteínas. Actualmente se están mapeando las señales responsables de las diferentes localizaciones como estudios funcionales de las mismas.

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