Señales involucradas en la proliferación cellular aumentan los niveles de expresión de RAC3 poracción directa a nivel de su promotor

ALVARADO C; MICENMACHER S; FERNANDEZ LARROSA P N; RUBIO M F; RUIZ GRECCO M; COSTAS M A

Mar del Plata, Buenos Aires

Congreso; SAIC 2009; 2009

Demostramos que el coactivador de receptores nucleares RAC3, es también coactivador de NF-kB y que tiene actividad protectora de la apoptosis y participa en la regulación de proteínas clave del ciclo celular. Aunque sus niveles son limitantes en células normales, su sobre-expresión se asocia al desarrollo de tumores tanto hormono-dependientes como independientes. Demostramos previamente que la citoquina TNF-a y el factor de transcripción NF-kB modulaban positivamente la expresión proteica de RAC3 en células no tumorales HEK293 (con bajos niveles del mismo). Con el objetivo de analizar si esta vía u otras señales desreguladas en tumorigenesis como el supresor tumoral P53 o condiciones de hipoxia previas a la angiogénesis podrían actuar en etiquetas blanco del promotor del gen de RAC3 y su efecto modulador sobre el mismo, se amplificó mediante PCR con primers específicos sobre ADN genómico la región de 967pb contiendo el primer exon del gen y fue clonada en el plásmido pGL3- basic río arriba del gen de luciferasa. La construcción fue transfectada en células HEK293, sola o simultáneamente con vector de expresión de los distintos factores: NF-kB, Ikb-ss y P53. Se observó un aumento de actividad luciferasa de un 300 +/-20% en contransfección con la subunidad RelA de NF-kB respecto de condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. en contransfección con la subunidad RelA de NF-kB respecto de condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3.kB y que tiene actividad protectora de la apoptosis y participa en la regulación de proteínas clave del ciclo celular. Aunque sus niveles son limitantes en células normales, su sobre-expresión se asocia al desarrollo de tumores tanto hormono-dependientes como independientes. Demostramos previamente que la citoquina TNF-a y el factor de transcripción NF-kB modulaban positivamente la expresión proteica de RAC3 en células no tumorales HEK293 (con bajos niveles del mismo). Con el objetivo de analizar si esta vía u otras señales desreguladas en tumorigenesis como el supresor tumoral P53 o condiciones de hipoxia previas a la angiogénesis podrían actuar en etiquetas blanco del promotor del gen de RAC3 y su efecto modulador sobre el mismo, se amplificó mediante PCR con primers específicos sobre ADN genómico la región de 967pb contiendo el primer exon del gen y fue clonada en el plásmido pGL3- basic río arriba del gen de luciferasa. La construcción fue transfectada en células HEK293, sola o simultáneamente con vector de expresión de los distintos factores: NF-kB, Ikb-ss y P53. Se observó un aumento de actividad luciferasa de un 300 +/-20% en contransfección con la subunidad RelA de NF-kB respecto de condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. en contransfección con la subunidad RelA de NF-kB respecto de condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3.a y el factor de transcripción NF-kB modulaban positivamente la expresión proteica de RAC3 en células no tumorales HEK293 (con bajos niveles del mismo). Con el objetivo de analizar si esta vía u otras señales desreguladas en tumorigenesis como el supresor tumoral P53 o condiciones de hipoxia previas a la angiogénesis podrían actuar en etiquetas blanco del promotor del gen de RAC3 y su efecto modulador sobre el mismo, se amplificó mediante PCR con primers específicos sobre ADN genómico la región de 967pb contiendo el primer exon del gen y fue clonada en el plásmido pGL3- basic río arriba del gen de luciferasa. La construcción fue transfectada en células HEK293, sola o simultáneamente con vector de expresión de los distintos factores: NF-kB, Ikb-ss y P53. Se observó un aumento de actividad luciferasa de un 300 +/-20% en contransfección con la subunidad RelA de NF-kB respecto de condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. en contransfección con la subunidad RelA de NF-kB respecto de condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3.kB modulaban positivamente la expresión proteica de RAC3 en células no tumorales HEK293 (con bajos niveles del mismo). Con el objetivo de analizar si esta vía u otras señales desreguladas en tumorigenesis como el supresor tumoral P53 o condiciones de hipoxia previas a la angiogénesis podrían actuar en etiquetas blanco del promotor del gen de RAC3 y su efecto modulador sobre el mismo, se amplificó mediante PCR con primers específicos sobre ADN genómico la región de 967pb contiendo el primer exon del gen y fue clonada en el plásmido pGL3- basic río arriba del gen de luciferasa. La construcción fue transfectada en células HEK293, sola o simultáneamente con vector de expresión de los distintos factores: NF-kB, Ikb-ss y P53. Se observó un aumento de actividad luciferasa de un 300 +/-20% en contransfección con la subunidad RelA de NF-kB respecto de condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. en contransfección con la subunidad RelA de NF-kB respecto de condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3.kB, Ikb-ss y P53. Se observó un aumento de actividad luciferasa de un 300 +/-20% en contransfección con la subunidad RelA de NF-kB respecto de condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. en contransfección con la subunidad RelA de NF-kB respecto de condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. condiciones basales, que disminuyó un 200 +/-20% en presencia de Ikb-ss super-represor que impide la activación de NF-kB y un aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. aumento de 50 +/-5% al ser estimuladas con TNF-a por 24hs. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3. Por cotransfección con P53 se vió un aumento del 450+/-30% mientras que al ser llevadas a condiciones de anaerobiosis 1%O2 por 3h se apreció una disminución de la actividad de 10+/-2%. Resultados similares se observaron a nivel proteico mediante western blot. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que las señales habitualmente involucradas en la proliferación celular y el desarrollo tumoral pueden ser responsables directas del aumento en los niveles de expresión de RAC3.