Clonado y caracterización de la región regulatoria 5´ del péptido antimicrobiano snakin-1

ALMASIA, NATALIA INÉS; BAZZINI, ARIEL ALEJANDRO; HOPP, H. ESTEBAN; VAZQUEZ-ROVERE, CECILIA

Buenos Aires- Argentina

Simposio; BAIRESBIOTEC 2005- VI SIMPOSIO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA- REDBIO ARGENTINA 2005-ENCUENTRO TRINACIONAL REDBIO ARGENTINA- CHILE-URUGUAY.; 2005

Introducción El  péptido Snakin-1, aislado recientemente de papa (Solamun tuberosum cv. Desireé),  forma parte de una nueva familia de péptidos antimicrobianos. Se ha registrado que presenta actividad in vitro, frente a patógenos fúngicos y bacterianos tanto de papa como de otras especies. Es el péptido mayoritario de tubérculo y su expresión ha sido detectada mediante ensayos de ?Northern Blot?, en tubérculos, vástagos, yemas axilares, y yemas florales jóvenes. Este patrón sugiere que este péptido podría ser un componente importante de las defensas constitutivas, primordial-mente en órganos reproductivos y de almacenamiento (Segura et al., 1999). El uso de  promotores tejido-específicos y el conocimiento de sus requerimientos particulares, permiten una expresión temporal y espacial específica de genes de interés agronómico. Con el fin de determinar las secuencias regulatorias en cis responsables de la expresión tejido-específica del gen snakin-1, este trabajo plantea la prospección y el estudio de la región situada río arriba del gen. Metodología PCR inversa (IPCR). Se digirió ADN extraído de hojas de plantas de Solanum tuberosum spp. tuberosum cv Kennebec con la enzima EcoRI, se realizaron diluciones (0,6; 6 y 24 ng/ml) y se autoligaron 14 horas a 16ºC. Sobre el producto de ligación se realizaron sucesivas PCR con los siguientes oligonucleótidos: 5´CCAGCCATGGTAGT TTGAATGAG3´ y 5´ATAGCCACTCC AGGGTGTCC3´, luego con 5´GTAGTTT GAATGAGAGAAGG3´ y 5´ATAGCCAC TCCAGGGTGTCC3´ y por último con 5´GTAGTTTGAATGAGAGAAGG3´ y 5´CAAAGTGCAAGCTGAGATGC3´. El programa utilizado fue: 1 ciclo de 94°C 4 minutos (min), 30 ciclos de: 94°C 1 min, temperatura   de    apareamiento    de      los oligonucleótidos X°C 1 min, 70°C  4,5 min, 1 ciclo de: 70°C 10 min. Clonado. Los productos de amplificación fueron clonados en pGEMt easy y se transformaron células E.coli según el protocolo de Sambrook et al (1989). Amplificación. En base a la secuencia de los clones se diseñaron oligonucleótidos que permiten amplificar un fragmento de 671 y otro de 448 pares de bases (pb) río arriba desde el codón de iniciación de la traducción. En estos últimos se incluyeron secuencias que son reconocidas por las enzimas de restricción BamHI y HindIII. Se amplificaron ambas versiones del promotor y se clonaron en los vectores p426 y pDMC206. Asimismo, ambas versiones de la región en estudio y una secuencia control fueron clonadas en un vector comercial apto para tranformación estable: pBI101.2. Transformación transitoria. Los explantos que se utilizaron fueron ápices, yemas y tubérculos de plantas de papa y catáfilas de cebolla. Se revistieron partículas de tungsteno Sylvania M10, con 10 µl de ADN 10 µg/µl, 50 µl de CaCl2 2,5 M, y 20 µl de espermidina 100mM. Se realizaron lavados y se resuspendieron en 60 µl de etanol absoluto. Se bombardeó mediante cañón génico empleando 10 µl de la suspensión de micropartículas por macrocarrier. Al cabo de 18 horas se realizó la tinción con la solución x-glu.  Transformación estable. Se  electroporaron bacterias Agrobacterium tumefaciens (LBA4404, pAL4404) y se llevaron a cabo ensayos según el protocolo de Rocha-Sosa et al. (1989). Resultados y Discusión Con el fin de obtener la región regulatoria del gen snakin-1 se desarrolló la técnica de IPCR obteniendo un producto de amplificación de 1100 pb. Su secuenciación determinó que, además de la secuencia conocida del gen, el producto estaba constituido por: una región correspondiente a 192 pb río abajo del ¨codón de terminación de la traducción¨ del gen snakin-1 y otra región de 671 pb río arriba del codón iniciador de la traducción. Esta última secuencia no presentó homología relevante en bases de datos nucleotídicas.  A fin de determinar el sitio de iniciación de la transcripción, denominado +1, se empleó un programa de predicción de secuencias de promotores eucariotas (Fruitfly). Este análisis sugirió la existencia de dos sitios ubicados a 557 y a  35 pb río arriba del codón de iniciación de la traducción. El segundo sitio resultó ser el más factible considerando las distancias y la secuencia de cDNA reportada. Asimismo, se identificó una secuencia correspondiente a un motivo TATA a 31 pb río arriba de dicho +1 seguido de un posible motivo CAAT a 16 pb río arriba del anterior. Las altas probabilidades halladas y el hecho de que los motivos coinciden con las posiciones de otros promotores reportados, sugieren que la secuencia aislada corresponde a una región promotora.  A fin de identificar potenciales elementos regulatorios en cis, se llevó a cabo un estudio in silica de dicha secuencia Acorde a la base de datos PLACE (Higo et al., 1999) y el programa Softberry existen 138 y 41 elementos regulatorios respectivamente. En tanto que el programa Genomatix-MatInspector basado en la  biblioteca IUPAC  de plantas exhibió la existencia de 30 motivos. Así, los principales elementos encontrados corresponden a sitios de unión de factores de transcripción relacionados con: inducción de auxinas; expresión tejido-específica; senescencia; activación por luz azul, blanca o UV-A; respuesta a deshidratación y a etileno entre otros. El alto número de putativos elementos regulatorios en cis indican que la secuencia aislada es una posible región promotora. Con el objetivo de realizar un análisis funcional de dicha secuencia la misma fue clonada, en dos versiones, río arriba del gen reportero que codifica para la enzima betaglucuronidasa. Las dos versiones se diferencian en 223 pb en la zona 5´ la cual incluye los principales motivos regulatorios. Tras realizar ensayos de expresión transitoria fue posible detectar la expresión de la proteína reportera en  catáfilas de cebolla, ápices, yemas axilares y tubérculos de papa confirmando que la secuencia aislada corresponde a una región promotora. Con el fin de caracterizar in-vivo dicha región promotora se llevaron a cabo ensayos de transformación estable de papa y tabaco. En ninguna de las líneas caracterizadas fue posible detectar la expresión de la proteína reportera mediante el método colorimétrico, sin embargo fue posible detectar la expresión del transgen mediante RT-PCR y ?Northern Blot?.  Se están llevando a cabo ensayos fluorimétricos de la actividad enzimática. Posteriormente se analizará la influencia de diferentes reguladores vegetales. A fin de clonar una secuencia mayor de esta región regulatoria se identificaron 10 clones positivos de una library comercial de Solanum bulbocastanum utilizando una sonda del gen snakin- 1. Sólo a partir de ADN correspondiente a dos de los clones fue posible amplificar la región promotora de 617 pb luego de realizar reacciones de PCR utilizando cebadores específicos. A partir de ADN digerido con las enzimas EcoRI, HindIII, XbaI y NcoI se realizaron ensayos de ?Southern Blot? empleando como sonda la región promotora revelando la existencia de fragmentos de entre 4000 y 6000 pb portadores del gen en estudio.  Actualmente estos fragmentos están siendo clonados y estudiados. Conclusiones En este trabajo se reporta el clonado y  secuenciación de una región de 671 pb ubicada río arriba del gen snakin-1 de Solanum tuberosum la cual corresponde a una región promotora. Referencias Bibliográficas Higo K, et al (1999) Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database: 1999. Nucleotid Acids Res 27:297-300 Rocha-Sosa, et al (1989).  Both developmental and metabolic signals activate the promoter of a class I patatin gene. EMBO J. 8:23-29 Sambrook, et al (1989). Molecular cloning, A laboratory Manual 2nd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press. Segura A, et al (1999) Snakin-1,a peptide from potato that is active against plant pathogens. Mol Plant- Microbe Interact. 12:16-23.