Cromatografía líquida multidimensional (Quiral x Aquiral). Aplicación a la enantioresolución de DNP-aminoácidos en muestras complejas

SIANO GABRIEL; FILGUEIRA MARCELO; ACQUAVIVA, AGUSTÍN; CASTELLS, CECILIA

Santa Rosa, La Pampa

Congreso; 10º Congreso Argentino de Química Analítica; 2019

AAQA

Las muestras biológicas, ambientales y de origen natural son generalmente mezclas altamente complejas en las que los compuestos de interés pueden aparecer como constituyentes menores. Como consecuencia, un gran exceso de interferencias puede dificultar la determinación directa de los compuestos de interés. El ensayo de muestras quirales agrega una complejidad adicional.La mayoría de las separaciones de enantiómeros por HPLC se realizan con columnas rellenas con una fase estacionaria quiral (FEQ) operada con una fase móvil aquiral. Un problema común que se encuentra con esta modalidad es la selectividad química intrínsecamente limitada de los rellenos quirales, sumado a las eficiencias bastante limitadas. Esto significa que las mezclas complejas de diversos pares de enantiómeros no pueden analizarse en un único análisis debido a la superposición de picos, y más aún cuando el analito está presente en muestras muy complejas que contienen otros compuestos aquirales pertenecientes a la matriz, que puede coeluir con los picos de enantiómeros.Las separaciones quirales en 2D-LC se desarrollan comúnmente en columnas de la segunda dimensión, especialmente en el modo ?Heart-cutting?1 (solo fracciones seleccionadas del eluyente de la 1D pasan a la 2D). Sin embargo, para mejorar el uso de un sistema 2D-LC, en este trabajo se usó la modalidad ?comprehensive? (donde toda fracción que sale de la 1D ingresa a la 2D), seleccionando a la FEQ en la 1D basados en su menor eficiencia cromatográfica, lo que permite muestrear cada pico varias veces. Y la 2D-LC se completa con una segunda dimensión que se desarrolla muy rápido para no perder la resolución obtenida en la 1D, y con la mejor selectividad ortogonal para obtener la mayor capacidad de picos para el análisis quiral de aminoácidos en muestras complejas. De esta manera pudimos demostrar la viabilidad de análisis enantioselectivo de mezclas naturales complejas. Las columnas quirales seleccionadas consisten en Quinina unida a mercaptopropilsilica, con una reacción final de recubrimiento con 1-hexeno3. El potencial enantiorreconocimiento de estas columnas se estudió en modo de intercambio aniónico con aminoácidos racémicos derivatizados con el reactivo de Sanger (DNP-aminoácidos).Otra ventaja del método desarrollado es la aplicación de una bomba divisora de flujo que permite: 1) ajustar fácilmente el volumen de muestra (con el solvente fuerte) transferido a la segunda dimensión y 2) utilizar un caudal independiente en la primera dimensión, sumado a un rápido re-equilibrio y un mejor uso del espacio de separación de la 1D2.El presente método LCxLC se optimizó con respecto a las características de la muestra y teniendo en cuenta todos los parámetros que influyen en la capacidad de pico bidimensional (ortogonalidad, frecuencia de muestreo, compatibilidad de las dimensiones, etc.).1M. Eugenia Leon-Gonzalez, et. al., Biomed. Chromatogr. 2014; 28, 59-83.2M. R. Filgueira, et. Al., Anal. Chem., 2011, 83 924), 9531-9539.3S. Keunchkarian et.al., J. Chromatogr. A 1218 (2011) 3660-3668.