ESTUDIO DE ASPECTOS NUCLEARES DE OVOCITOS BOVINOS COMPETENTES E INCOMPETENTES PARA EL DESARROLLO IN VITRO.

RACEDO SILVIA; ESPAÑOL ALEJANDRO; SALAMONE DANIEL; RAWE VANESA

Córdoba, Argentina

Jornada; VI Simposio Internacional de Reproduccion Animal; 2005

El objetivo del presente estudio fue evaluar posibles diferencias en la distribución de proteínas asociadas a la estructura nuclear y a los microtúbulos en ovocitos provenientes de folículos mayores a 2mm (ovocitos competentes, grupo control) y ovocitos provenientes de folículos menores a 2mm (ovocitos incompetentes). La maduración ovocitaria incluye cambios nucleares y citoplasmáticos, siendo el complejo Ciclina B/ kinasa p34(cdc2), MPF, el principal regulador de estos eventos. MPF fosforila tanto a Lamin A/C (citoesqueleto nuclear) como a NuMA (asociación con microtúbulos en mitosis y con los núcleos en interfase) para dar lugar a la desorganización de la envoltura nuclear y a la interacción con los microtúbulos respectivamente. Los ovocitos incompetentes tienen una menor capacidad de desarrollo embrionario. Nuestra hipótesis de trabajo se centró en la visualización de ciertas estructuras importantes durante la maduración ovocitaria hasta alcanzar el estadio de metafase II (MII) que podrían influir en este trastorno. En el presente trabajo, los complejos ovocito-células del cúmulus (COC) se colectaron desde ovarios provenientes del matadero local. Se punzaron y aspiraron folículos ³2mm y pequeños <2mm, se seleccionaron y fijaron los ovocitos en distintos tiempos. Los tiempos estudiados fueron: 0 hs. de maduración in vitro (estadio de vesícula germinal, VG) y luego de 24 hs. de cultivo (MII) en medio M199; 5% SFB; 2 mg/ml de FSH; en 5% CO2 y 100% de humedad a 39ºC La detección de proteínas se realizó por inmunofluorescencia. Se detectó Lámina A/C, el antígeno mitótico nuclear (NuMA) y tubulina (E7) en relación a las láminas de la envoltura nuclear, la asociación con microtúbulos durante el ciclo celular y los microtúbulos respectivamente. La fijación fue realizada en buffer estabilizador de microtúbulos (Buffer M) con glicerol y 10% de metanol. Posteriormente se realizó la incubación con el anticuerpo 1º y 2º acoplado a un fluorocromo. El ADN fue visualizado con TOTO-3 y/o el intercalante de ADN Hoescht 33342. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal espectral Olympus. Independientemente de la detección de proteínas se evaluó el porcentaje de ovocitos competentes e incompetentes que alcanzaron MII (maduración nuclear) luego de 24 hs. de cultivo en condiciones estándares de maduración. Los resultados de este experimento fueron analizados por Chi-cuadrado con diferencias estadísticamente significativas cuando p‹0,01. Se observó un porcentaje de maduración nuclear significativamente menor en el grupo de ovocitos incompetentes comparado con el control, 31% vs 52% respectivamente.  Respecto a la localización de Lamin A/C se observó una distribución anormal y/o ausencia de la proteína en el 69% (18/26) de las vesículas germinales de ovocitos incompetentes observados, comparado con la mayoría de los ovocitos del grupo control que presentaron una estructura homogénea normal. No se observaron diferencias en el patrón de distribución de esta proteína en MII entre ambos grupos. Contrariamente, la distribución de NuMA fue anormal en el 70% de las vesículas germinales incompetentes (16/23) y en el 78% de los ovocitos incompetentes en estadio de metafase II (21/27). Este patrón fue significativamente distinto al observado en el grupo control. No se ha observado una asociación clara entre NuMA y los microtúbulos del huso meiótico en MII en el grupo incompetente. Podemos concluir que los ovocitos incompetentes presentan una menor eficiencia para completar la maduración nuclear y que proteínas importantes de la estructura nuclear y del ciclo celular muestran un patrón anormal en su distribución.