ESTUDIO DE ASPECTOS CITOPLASMÁTICOS DE OVOCITOS BOVINOS COMPETENTES E INCOMPETENTES PARA EL DESARROLLO IN VITRO

RACEDO SILVIA; ESPAÑOL ALEJANDRO; GUERRA ALEJANDRO; SALAMONE DANIEL; RAWE VANESA

Córdoba, Argentina

Simposio; VI Simposio Internacional de Reproduccion Animal; 2005

El objetivo del presente estudio fue evaluar posibles diferencias en la distribución de organelas (Golgi y retículo endoplásmico) en ovocitos provenientes de folículos mayores a 2mm (ovocitos competentes, grupo control)  y ovocitos provenientes de folículos menores a 2mm (ovocitos incompetentes). El proceso de maduración ovocitaria involucra una serie compleja de eventos moleculares y estructurales, que culmina con el arresto de los cromosomas en metafase II (maduración nuclear) y una redistribución de organelas que incluye al aparato de Golgi y al retículo endoplásmico entre otros (maduración citoplasmática). Los ovocitos bovinos provenientes de folículos menores a 2mm tienen menor capacidad para alcanzar in vitro el estadio de blastocisto. Esta pérdida de la capacidad de desarrollo podría estar relacionada a una falla en la secuencia de eventos que conducen al ovocito al estadio de metafase II (MII) luego de 24 hs. de cultivo. Siendo el complejo Ciclina B/ kinasa p34(cdc2), MPF, el principal regulador de la maduración ovocitaria. MPF fosforila a GM-130 (proteína de la matríz de Golgi) en la serina 25, mientras que la fosfatasa PP2A desfosforila este residuo durante la telofase. Como los ovocitos de mamíferos contienen gran cantidad de ARNm y proteínas de ciclina B1, ciclina B2, p34(cdc2) y PP2A, es probable que estas moléculas actúen sobre ciertas proteínas de la matríz del sistema de vesículas de Golgi durante la meiosis para particionar y relocalizar esta organela. Los complejos ovocito-células del cúmulus (COC) se colectaron desde ovarios provenientes del matadero local. Se punzaron y aspiraron folículos ³2mm (grupo control) y pequeños <2mm, se seleccionaron y fijaron los ovocitos en distintos tiempos. Los tiempos estudiados fueron: 0 hs. de maduración in vitro (estadio de vesícula germinal, VG) y luego de 24 hs. de cultivo en medio M199; 5% SFB; 2 mg/ml de FSH; en una atmósfera con 5 % CO2 en aire y 100% de humedad a 39ºC (MII). La detección de proteínas se realizó por inmunofluorescencia. La fijación y permeabilización de los ovocitos fue realizada con formaldehído 2% y Triton X-100 0,1 % respectivamente. El sistema de vesículas de Golgi y el retículo endoplásmico (RE) fueron identificados utilizando GM-130 y Calreticulina respectivamente. El bloqueo de sitios inespecíficos fue hecho antes de la incubación con el anticuerpo 1º y 2º acoplado a fluorescencia. El ADN fue visualizado con TOTO-3 y/o Hoescht 33342. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal espectral Olympus. Se observó una distribución anormal de GM-130 y Calreticulina en el 63% (12/19) de los ovocitos incompetentes en MII comparado con la mayoría del grupo control. El patrón de distribución observado en el grupo incompetente consiste en el agrupamiento anormal de Golgi hacia el centro de la célula (co-localizando con el RE) en comparación al observado en el grupo control en donde Golgi se distribuye en todo el citoplasma de manera homogénea y puntillada, mientras que el RE lo hace de manera cortical. Podemos concluir que los ovocitos incompetentes presentan una menor eficiencia en el proceso de vesiculización y relocalización del aparato de Golgi y el RE durante la maduración ovocitaria. Un sistema de endomembranas (Golgi y RE) normal es de fundamental importancia para sustentar un desarrollo embrionario viable. Es necesario ampliar la muestra de estudio para poder definir tendencias más certeras en cuanto a la distribución de estas organelas y su asociación con otras proteínas importantes durante la señalización intracelular en la maduración ovocitaria.