Sphingosine-1-phosphate promotes a migratory phenotype of melanoma cells in hypoxia

PEREZ CN; CASTRO MG; CAMPOS LE; RODRIGUEZ YI; RAMIREZ DC; ALVAREZ SE

Buenos Aires CABA

Congreso; LXI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC); 2017

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

En los últimos años, la incidencia del melanoma ha aumentado rápidamente. Aproximadamente la mitad de los pacientes con melanoma presentan la mutación V600E en laquinasa BRAF (BRAFV600E), la cual incrementa su actividad y promueve la progresión del tumor a través de la estimulación de proteínas quinasas reguladas extracelularmente(ERK). La Administración de Drogas y Alimentos de Estados Unidos (FDA) ha aprobado el uso de 4 nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de melanoma avanzado quemodulan la vía de señalización de ERK por medio de dos mecanismos diferentes: i) inhibidores de BRAF (Vemurafenib 2011 y Dabrafenib 2013) y ii) inhibidores de MEK(Trametinib 2013 y Cobimetinib 2015). En Argentina, la droga vemurafenib está aprobada por la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica(ANMAT). Desafortunadamente, la durabilidad de la respuesta es limitada y los tumores se vuelven rápidamente resistentes, adoptando un fenotipo agresivo que conduce a lametástasis. Numerosos mecanismos de resistencia se han reportado, incluyendo entre otros la activación paradójica de MAPK por la quinasa CRAF, inducción de STAT3 yactivación de Akt. Recientemente, también se ha demostrado que la hipoxia intratumoral (Hx), una característica distintiva del microambiente tumoral (MT) del melanoma,también participa en los mecanismos de resistencia. Esfingosina-1-fosfato (S1P) es un lípido producido intracelularmente por la acción de dos esfingosina quinasas (SphK1 ySphK2) que cumple importantes funciones en procesos inflamatorios y tumorales. Precisamente, numerosos estudios demuestran una regulación bidireccional entre Hx ySphK1. Considerando estas evidencias, el objetivo de este trabajo fue evaluar el rol de vemurafenib en la viabilidad y migración de células de melanoma en Normoxia (Nx) e Hx ysu relación con S1P. Utilizamos como modelo experimental células de melanoma humano Lu1205 que presentan la mutación BRAFV600E. Las células se cultivaron en Nx o enuna cámara especial con una mezcla de Hx (1 % O2, 5 % CO2) a 37 °C. La viabilidad celular se analizó mediante el método de MTT, mientras que la migración celular por WoundHealing Assay (WHA). Los resultados demuestran que S1P no afecta la viabilidad de células Lu1205 en ambas condiciones. No obstante, solo en Hx, S1P induce un incrementosignificativo de la migración, sugiriendo que es importante para que las células adopten un fenotipo migratorio en el ambiente de escasez de oxígeno propio del MT delmelanoma. Por otro lado, el tratamiento con Vemurafenib (10 µM) inhibe la viabilidad y la migración celular en Nx, pero no en Hx. Destacablemente, vemurafenib tambiénreduce la migración inducida por S1P en Hx. Mediante ensayos de western blot observamos que el tratamiento con vemurafenib durante 48 horas inhibe la fosforilación de ERKen Nx pero no en Hx. Es importante resaltar que luego de 72 horas de tratamiento con vemurafenib los niveles de pERK se restablecen a sus valores basales.En su conjunto, estos resultados demuestran que el efecto inhibitorio de Vemurafenib sobre la viabilidad y migración de células de melanoma está ampliamente reducido en laszonas del tumor deprivadas de oxígeno. Vemurafenib favorecería la progresión tumoral por un mecanismo independiente de S1P y dependiente de la reactivación de la víaMAPK. En conclusión, nuestros resultados sugieren la Hx intratumoral favorece la resistencia a vemurafenib y por lo tanto actúa como una característica permisiva para elcrecimiento y potencial metástasis del melanoma