Activación de genes de la célula beta pancreática mediante el uso de sistemas activadores CRISPR: bases para la transdiferenciación celular pancreática humana.

GIMENEZ CARLA; CURTI LUCIA; GROSEMBACHER LUIS; PEREYRA-BONNET FEDERICO; HYON, SUNG HO

Mar del Plata

Congreso; XXI Congreso Argentino de Diabetes; 2018

Sociedad Argentina de Diabetes

Introducción: La transdiferenciación celular se define como la conversión de un tipo de célula adulta hacia otro por la activación directa de genes linaje-específico. Este fenómeno ocurre de manera natural en el páncreas durante el desarrollo cuando la masa beta pancreática sufre una baja en modelos animales. Tales descubrimientos abren la posibilidad de explorar la manipulación de la regulación génica como potencial terapia celular in vivo para tratar la Diabetes mellitus tipo 1 (DM1). Nuestro grupo demostró que los sistemas de activación génica CRISPR pueden activar factores de transcripción específicos del linaje beta pancreático (TFB)Objetivos: En este trabajo se exploró: A) la capacidad de CRISPR dCas9-P300 de convertir a la línea celular modelo HEK293 en células que expresan el gen de Insulina; y B) un delivery completo de ARN mensajero del sistema. Materiales y métodos: Para ello, se usaron técnicas moleculares y celulares. A) Se diseñaron 4-5 ARNg para cada promotor proximal de los TFB (PDX1, NEUROG3 y PAX4). Se clonaron en un vector de expresión de ARNg (Addgene#47109) y se transfectaron en células HEK293 transgénicas para dCas9-P300 en el día 1, día 4 y día 7. Estas células fueron cultivadas con medio común de cultivo (90%DMEN,10%SFB y 1%ATB) hasta el día 5. Para el grupo 1, se mantuvo este mismo medio hasta el día 10; para el grupo 2, se cambió al medio TM (40 ng/mL bFGF,20%SFB,2mM glutamina, 0.1mM β-met.,25nM TSA y 1µM 5-azacytidina). B) Se obtuvo mediante transcripción in vitro (IVT) el ARN que codifica dCas9-P300, el cual junto a los ARNg sintéticos (Synthego, CA) fueron transfectados en HEK293.Resultados: A) Al día 10 por RT-PCR observamos que el grupo 1 solo tenía una leve activación de Insulina cuando los TFB se transfectaban en forma secuencial (1° PDX1, 2° NEUROG3 y 3° PAX4). En cambio, para el grupo 2 hubo expresión de Insulina, ya sea si los TFB se transfectaban simultáneamente o en forma secuencial. B) Este sistema que solo usa ARN como delivery del sistema al día 4 también mostró activación de sus targets por RT-PCR. Para todos los casos el control fueron células sin transfectar. Conclusiones: El sistema CRISPR dCas9-P300 resultó una herramienta eficaz en la diferenciación a células que expresan Insulina in vitro. Asimismo, el sistema activa cuando es dirigido solo como ARN mensajero, lo cual facilitaría el empleo de CRISPR en la clínica. En definitiva, CRISPR es una herramienta de prometedor uso en protocolos de terapia celular basados en la transdiferenciación para tratar la DM1.