Identificación de un gen en la especie silvestre de papa Solanum kurtzianum homólogo al gen mi de resistencia a nematodos en tomate

SEGURA D., MARFIL C., PERALTA I., MASUELLI R.

Buenos Aires

Congreso; Congreso BAIRES BIOTEC 2005; 2005

REDBIO ARGENTINA

Introducción El nematodo del nudo es una plaga del suelo que causa daños importantes en el cultivo de la papa. Específicamente Meloidogyne incognita es la especie más relevante en zonas templado cálidas. Este nematodo produce pérdidas de rendimiento, afecta la calidad de los tubérculos y además no cuenta con un método de control que sea efectivo, ambientalmente seguro y económicamente rentable. Una alternativa para su control es la incorporación de resistencia genética estable a esta plaga a través del uso de las especies silvestres relacionadas que tengan resistencia o a través de la incorporación por ingeniería genética del gen de resistencia. En tomate, el gen mi confiere resistencia a Meloidogyne spp. y ha sido clonado y caracterizado molecularmente (Martinez de Ilarduya et al. 2001) . Dado que las especies de tomate y papa están muy emparentadas y sus genomas son muy similares, el objetivo de este trabajo es aislar un gen homólogo al mi de tomate en la especie de papa S. kurtzianum (ktz), donde encontramos genotipos con resistencia a Meloidogyne Metodología Se realizó un ensayo preliminar para seleccionar genotipos de ktz por su resistencia a la infección por M. incognita. El genotipo 8II, mostró tolerancia hacia el nematodo, por lo que se realizaron cruzamientos interespecíficos con un haploide de S. tuberosum (2n=2x=24). Se obtuvieron 3 híbridos, sobre los cuales se realizó la prueba de resistencia. Esta prueba consiste en inocular los diferentes genotipos con concentraciones conocidas de larvas del nematodo. Transcurridos 60 días, se evalúa la infección contando nódulos en las raíces de las plantas. Análisis Molecular Se trabajó con la planta de ktz 8II. El ADN fue extraído según el método Dellaporta, para luego ser utilizado en reacciones de PCR. La secuencia del gen mi de tomate fue alineada con una secuencia ESTs (expressed sequences tag) reportada en papa en la base de datos TIGR (TC 116426). Se encontraron 5 bloques conservados entre las dos especies, a partir de los cuales se sintetizaron “primers” degenerados usando el programa BLOCKS CODEHOP (COnsensus DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers). La secuencia de los “primers” sintetizados fueron las siguientes: A-Mi: 5´-TGAACGGCGAGGTGGARGTNATG AA-3´; Bc-Mi: 5´-CCTCCTCCACGGAC TTCATYTCNGT-3´; E-Mi: 5´-CCCTGTC CTTCTCCAAYYTNTGGAA-3´; Fc-Mi: 5´-TTCAGCTTCTCCAGCTTGGTRTCY TCNGC-3´; Jc-Mi: 5´-CCTTCTGGCCCA GGATCTGNARYTCRTC-3´. Un fragmento obtenido de una amplificación por PCR satisfactoria fue clonado en el plásmido pGEM T-easy (Promega) y secuenciado. La secuencia obtenida fue alineada con el gen mi de tomate. Resultados y Discusión El genotipo 8II de ktz presentó tolerancia a la infección por M. incognita con respecto al control, altamente susceptible S. tuberosum (tbr 4x). El análisis de la infección en los tres híbridos interespecíficos mostró que los mismos presentan niveles de tolerancia a la enfermedad semejantes a los de ktz 8II (Tabla 1). Tabla1: Evaluación de la infección a M. incognita Genotipo M.hv/gr.raíza Suscep.b tbr 4x 156.49 aefi AS ♀ tbr 2x 168.25 abef AS ♂ ktz 8II 29.45 cgh LS Híbrido 1 59.38 acdh LS Híbrido 3 23.84 bdh LS Híbrido 4 72.80 ace MS aValores promedio del nº de masas de huevos/gramo de raíz. Valores seguidos de letras distintas difieren al 5% (Duncan) bLevemente susceptible (LS): 16-60 M.hv/gr.raíz; Moderadamente susceptible (MS): 61-100 M.hv/gr.raíz; Altamente susceptible (AS): más de 100 M.hv/gr.raíz La resistencia al nematodo del tomate cultivado (Solanum esculentum) proviene del gen mi de la especie silvestre S. peruvianum. En base a esto, y con el fin de elucidar las bases genéticas y moleculares de la resistencia al nematodo en papa se utilizaron “primers” degenerados para amplificar un gen homólogo en S. kurtzianum. Utilizando la combinación de “primers” forward A-Mi y reverse Jc-Mi se amplificó un fragmento de 1.6 kb (Figura I). El fragmento obtenido fue purificado a partir del gel de agarosa y clonado para su posterior secuenciación. Utilizando el programa Clustal W se compararon la secuencia obtenida con la del gen mi de tomate. El resultado del alineamiento demostró que la secuencia de papa presenta una similitud de 87% con el gen mi de tomate. El gen mi en tomate tiene aproximadamente 4 kb (Milligan et al, 1998), y de acuerdo con el análisis de la secuencia hemos logrado clonar el extremo 3´ del gen en papa. Conclusiones La herencia del carácter de resistencia a M. incognita observado en ktz 8II podría estar controlado por un gen o pocos genes simples ya que los híbridos presentaron niveles de infestación similares a los del padre (ktz 8II). Por otro lado, a través de genómica comparativa, demostramos que el genotipo de ktz utilizado tiene un gen homólogo al gen mi de tomate que confiere resistencia a Meloidogyne spp. Hasta el momento no se ha clonado en papa un gen de resistencia a esta plaga. Hacerlo nos permitirá avanzar en el conocimiento de este gen de resistencia no descrito y acelerar su transferencia a la papa cultivada. Referencias bibliográficas Martinez de Ilarduya O, et al, 2001, The -Plant Journal, 417-425 Milligan S, et al, 1998, The plant cell, Vol. 10, 1307-1319