Estudio de comparativo de la aplicabilidad y el desempeño de diferentes métodos para la cuantificación de ADN

VERA, P. A.; FRETES, V. C.; MUÑOZ HIDALGO, M. G.; NISHINAKAMASU, V.; MEDINA, M. D.; MARTÍNEZ, M. C.; PANIEGO, NORMA; HEINZ, R. A.; PUEBLA, A. F.; PEDROARIAS, V. C.

San Miguel de Tucumán

Simposio; X Simposio Nacional de Biotecnología REDBIO; 2015

En el presente trabajo se evaluaron diferentes equipos y metodologías disponibles en los laboratorios de biología molecular para la cuantificación de ADN, con el fin de comparar su desempeño y establecer la aplicabilidad de cada metodología en las etapas previas de los ensayos de qPCR, secuenciación por electroforesis capilar, secuenciación de alto rendimiento (o NGS), etc.Se utilizó un ADN ultrapuro de timo de ternera comercial y diferentes tipos de muestras de ADN purificadas por métodos tradicionales y kits comerciales:- ADN plasmídico- Productos de PCR- ADN genómico de maíz- ADN de soja con alto grado de fragmentación.- ADN genómico de soja con contenido significativo de materia orgánica (relación de abs 230/260 < a 1.6)Para cada tipo de muestra se evaluó la repetibilidad y la reproducibilidad de los resultados a diferentes concentraciones de ADN. Se utilizaron los siguientes equipos: fotómetro UV/VIS Nanodrop ND1000, espectrofluorómetro de placas SpectraMax GeminiEM, fluorómetro Qubit 2.0 y analizador de ácidos nucleicos Fragment Analyzer Advanced Analitycal..La repetibilidad y reproducibilidad intermedia de los resultados de cuantificación de ADN por los diferentes métodos fueron estimados a partir de 30 medidas.En los ensayos llevados a cabo con muestras de ADN ultrapuro no se observó sesgo significativo en los diferentes tipos y concentraciones de muestras en ninguno de los métodos y equipos ensayados. El mejor desempeño a altas concentraciones de ADN se obtuvo en el fotómetro Nanodrop ND1000, mientras que en bajas concentraciones de ADN el mejor desempeño fue observado en el fluorómetro Qubit 2.0.Para la prueba de repetibilidad el mayor coeficiente de variación se obtuvo en el espectrofluorómetro de placas SpectraMax GeminiEM.La evaluación de las variabilidades encontradas en extractos de menor calidad o por la utilización de diferentes métodos de extracción permitirá elegir el método más adecuado según el ensayo a realizar, así como a evitar repeticiones en la cuantificación y pérdida de muestra.