UTILIZACIÓN DE UNA PCR ANIDADA PARA NEOSPORA CANINUM PARA DIAGNÓSTICO EN TEJIDOS DE FETOS BOVINOS ABORTADOS

HECKER YP; MORRELL E.; CANTÓN G.; LISCHINSKY L.; CANO D.; LEUNDA M.R.; ODEÓN A.; CAMPERO C.M.; MOORE D.P.

San Miguel de Tucumán

Congreso; XX REUNIÓN CIENTÍFICO TÉCNICA DE LA ASOCIACIÓN ARGENTINA DE VETERINARIOS DE LABORATORIOS DE DIAGNÓSTICO; 2014

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico

Introducción: Neospora caninum es uno de los agentes más frecuentemente implicado como causa de aborto bovino en los fetos que ingresan al Servicio de Diagnóstico Veterinario Especializado (SDVE) del INTA EEA Balcarce. Debido a que el aislamiento del protozoo es dificultoso, el diagnóstico se realiza mediante la identificación de anticuerpos contra éste agente en líquido de cavidades fetales [usando inmunofluorescencia indirecta (IFI) o ELISA] o la presencia de lesiones compatibles observadas durante el análisis histopatológico y la identificación de antígeno en éstos tejidos mediante inmunohistoquímica (IHQ). Recientemente incorporamos la técnica de PCR anidada (nPCR, de su sigla en inglés nested-PCR) para la identificación de ADN parasitario en tejidos fetales. El objetivo del presente trabajo fue valorar la utilidad de la incorporación de la nPCR en el mejoramiento de la eficiencia de diagnóstico de la neosporosis en el aborto bovino. Materiales y métodos: Se seleccionaron tejidos congelados (-80ºC) recolectados de fetos bovinos abortados recibidos en el SDVE durante el período 2006-2012 que presentaron lesiones compatibles con las producidas por N. caninum en el análisis histopatológico y que fueron positivos a la técnica de IHQ y/o IFI. Inicialmente se eligieron muestras de encéfalo y en los casos que no estuvieran disponibles se procesaron muestras de hígado, pulmón y/o corazón. La extracción del ADN se realizó utilizando un kit comercial (DNeasy®, Blood and Tissue kit, QIAGEN, Frankfurt, Germany) según protocolo sugerido por el elaborador. Se cuantificó la cantidad de ADN extraída mediante espectrofotometría (Epoch micro-volume spectrophotometer system, Epoch, Bioteck® Instruments Inc., Vermont, USA) y se diluyeron las muestras en agua ultra pura a una concentración final de 60 ng/µl. Finalmente, se utilizó la nPCR que amplifica la región ITS1 del ADN ribosomal de N. caninum. Resultados: Se analizaron tejidos recolectados de 35 fetos, todos con lesiones compatibles con N. caninum (encefalitis, hepatitis, neumonía y/o miocarditis no supurativa). De este total, 4 fetos eran positivos a IFI e IHQ, 10 eran positivos sólo a IFI y 5 sólo a IHQ. Cuando se aplicó la nPCR, 12/35 fetos resultaron positivos (Tabla 1) de los cuales 4 habían sido previamente positivos sólo a la IFI, 3 sólo a la IHQ y 3 habían resultado negativos tanto a la IFI como la IHQ. Discusión y conclusiones: La implementación de la nPCR mejoró la eficiencia de diagnóstico etiológico de N. caninum ya que en 3 fetos que habían presentado lesiones compatibles no se había podido detectar directa o indirectamente el protozoo (negativos a IHQ e IFI). Así mismo, el empleo de la nPCR permitió confirmar el diagnóstico etiológico en 4 fetos en los que sólo se habían detectado anticuerpos contra el agente (positivos a IFI, negativos a IHQ). Sin embargo, en tejidos de 5 fetos que eran positivos a IHQ no se detectó ADN parasitario mediante PCR. La razón de esto pudo haber sido la presencia inmuno-marcaciones falso-positivas. Por otra parte, la existencia de anticuerpos contra N. caninum en 10 fetos que resultaron negativos tanto a la IHQ como a la nPCR pudo ser causada por una infección congénita con baja carga parasitaria en los tejidos analizados. Teniendo en cuenta que la eficiencia del diagnóstico etiológico de las pérdidas reproductivas en el ganado bovino es muy baja, el presente trabajo demostró que la implementación de técnicas moleculares en la rutina de diagnóstico de N. caninum mejora la sensibilidad en la detección del parásito. Si bien un resultado positivo individual de una nPCR no es confirmatorio de un diagnóstico, complementa a otras técnicas de laboratorio y a la información anamnésica disponible.