Desarrollo de una Real Time PCR basada en SYber Green para la detección de parvovirus porcino y virus de la enfermedad de Aujeszky

ASPITIA C; GILEAD T; ORIGLIA J; METZ G. E; ECHEVERRIA M. G; SERENA M. S.

Rio Cuarto

Congreso; XXII Reunión Científico-Técnica de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico (AAVDL; 2018

INTRODUCCION En Argentina como en otros países donde la producción porcina es de importancia, las fallas reproductivas asociadas a causas infecciosas siguen causando problema, sobre todo si no se lleva a cabo un adecuado plan de vacunación. Dentro de los agentes patógenos involucrados, los de mayor impacto en el síndrome de falla reproductiva son los agentes virales, estando presentes en el país el Parvovirus porcino (PPV), el virus de la Enfermedad de Aujeszky (EA) o Pseudorrabia (PRV) y el Circovirus porcino tipo 2 (PCV-2). El PPV pertenece a la familia Parvoviridae y es considerado la causa infecciosa más importante asociada a fallas reproductivas en granjas porcinas. Es un virus ADN de cadena simple y polaridad negativa, de un tamaño aproximado de 5 kb y está ampliamente distribuido tanto en cerdos domésticos como salvajes. El virus de EA pertenece a la familia Herpesviridae y su infección conlleva a severas pérdidas económicas en todo el mundo. Es un virus ADN doble cadena cuyo genoma es de aproximadamente 150 kb. La signología clínica asociada a este virus puede ser tanto reproductiva, respiratoria o neurológica. Como la falla reproductiva en las piaras afecta de manera significativa los beneficios del negocio agropecuario, es importante reducir su impacto. Para esto, es crucial desarrollar una técnica diagnóstica eficaz y rápida para poder cubrir las demandas del sector productivo. Las técnicas moleculares que permiten la detección de genoma son muy usadas para el diagnóstico a nivel mundial. La real-time PCR basada en Syber Green ha demostrado ser una técnica efectiva en la detección rápida y diferencial como así también en la cuantificación de genomas de una gran variedad de patógenos virales.El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una técnica rápida, sensible y específica que permitiera detectar e identificar dos de los agentes causales de las fallas reproductivas más importantes del sector.MATERIALES Y METODOSEn primer lugar, se diseñaron pares de cebadores utilizando programas específicos como el DNAman y Primers Express basándose en secuencias reportadas en el Genbank. Los juegos de cebadores fueron diseñados teniendo en cuenta las regiones con menor variabilidad genética de cada virus, y en el caso de EA se tuvo en cuenta la necesidad de lograr una técnica de PCR que permitiera diferenciar entre animales vacunados de infectados. Se diseñaron dos pares de cebadores, un par que amplifica la región gE (ausente en la cepa vacunal) y un par para la región gD. En el caso del PPV se diseñó un par de cebadores que amplifica la región NS1. A partir de células infectadas con las cepas de EA, TL92 y Bartha vacunal e Hipra-PPV, se extrajo el ADN. En primera instancia de pusieron a punto cada una de las técnicas de PCR individual. Se realizaron diferentes pruebas variando las concentraciones de reactivos y modificando los tiempos de extensión de los ciclos de cada etapa de la PCR. Finalmente se logró definir un único programa de ciclado individual para posteriormente ser utilizado en la técnica de multiplex. Para la mezcla de reacción de 25 µl se utilizó 3mM de MgCl2, 0,4 mM de DNTps, 0,2 mM de cada cebador, 7% de DMSO, 1U de TagDNApol y 10% de buffer TagDNApol. El programa de ciclado establecido fue: 95°C 5 min; 35 ciclos de 95°C45 seg, 60°C 45 seg, 72°C 45 seg; y una extensión final de 72°C 7 min. Para la puesta a punto de la técnica multiplex se utilizó el mismo programa de ciclado y se mantuvieron las concentraciones de cada reactivo establecidas. Los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio. Para la técnica de real time PCR se llevó a cabo utilizando Syber Green como reactivo indicador empleando dos diluciones en base 10 de cada ADN viral. Las reacciones se realizaron en forma individual y luego en un mismo tubo en forma simultánea se colocó ADN de TL92 y ADN de Hipra-PPV; y en otro tubo se colocó ADN de Bartha vacunal y ADN de Hipra-PPV. En ambos tubos de colocaron los tres juegos de cebadores diseñados (gDm, gEm y PPVm). Las curvas obtenidas fueron analizadas y posteriormente correlacionadas con la temperatura de melting individuales de cada producto amplificado. RESULTADOSTras la reacción de PCR convencional los productos obtenidos fueron 150bp para PPV, uno de 220bp para gD-PRV y uno de 500bp para gE-PRV. Luego de la realización de real time PCR se analizaron las curvas correspondientes a las temperaturas de melting obtenidas. Como se observa en la figura 1, las curvas de las reacciones individuales se condicen con las observadas en la reacción múltiple. La curva de amplificación de la región que codifica para la proteína gE del virus de la EA corresponde a una temperatura de 92˚C, la curva asociada a la proteína gD a 86˚C, y por último a 78˚C podemos observar la curva correspondiente a la amplificación del fragmento NS1 de PPV. DISCUSION Y CONCLUSIONSi bien quedan detalles para evaluar, la reacción estandarizada es capaz de diferenciar en un único paso la presencia de virus vacunal o virus de campo para el caso de EA y la presencia de PPV. A futuro, la técnica debería evaluarse con muestras de campo para valorar su uso como herramienta diagnóstica. La validación de esta técnica sería muy útil para cubrir los requerimientos del sector productivo, otorgando un diagnóstico rápido y confiable de causas infecciosas de falla reproductiva, a partir de muestras de natimortos o abortos porcinos.