ESTUDIO DEL PROCESO DE TRANSFERENCIA ELECTRONICA INTRAMOLECULAR EN LA NITRITO REDUCTASA DEPENDIENTE DE Cu (NirK)

DURÉ, ANDREA B.; GONZALEZ, PABLO J.; RIVAS, MARÍA G.; CRISTALDI, JULIO C.; FERRONI, FELIX M.; RIZZI, ALBERTO C.; BRONDINO, CARLOS D.

San Miguel de Túcuman

Congreso; XXI Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica.; 2019

Universidad Nacional de Tucumán

Introducción. La nitrito reductasa dependiente de cobre (NirK) es una enzima clave del ciclo geoquímico del N, ya que cataliza la conversión de nitrito (NO2-) en óxido nítrico (NO?), un gas de efecto invernadero que además es capaz de degradar el O3 en la atmósfera.1,2 Para comprender el funcionamiento de esta enzima, caracterizamos mediante técnicas cinéticas y espectroscópicas diferentes variantes sitio-dirigidas que modifican el entorno de coordinación y/o los potenciales de reducción (Eº?) de los centros de cobre tipo I (T1) y tipo II (T2) presentes en NirK.Resultados. NirK wild-type (wt) y las variantes H171C y E315A fueron producidas de forma recombinante. H171C se generó para modificar directamente el puente Cys-His que conecta los dos iones Cu de NirK, mientras que E315A se produjo para estudiar cómo la modulación del Eº? del sitio activo (T2) afecta la velocidad de transferencia electrónica (kET) T1T2 y la cinética de reducción de nitrito a NO. Se utilizaron técnicas cinéticas de estado estacionario, y espectroscopías de absorción UV-Vis y CW-EPR.Las propiedades moleculares de las variantes (estructura cuaternaria, contenido de metales) son similares a las de wt-NirK. Las espectroscopias UV-Vis y EPR mostraron que ambas variantes contienen centros de Cu T1 y T2 en estado cúprico (Cu2+, [Ar] 3d9), aunque las señales EPR correspondientes a los T2 fueron ligeramente diferentes a las de wt-NirK. Además, E315A produjo una kcat idéntica a wt-NirK (20 s-1), pero una KM tres veces más grande (60 µM). H171C no mostró actividad catalítica.Conclusiones. Los residuos de aminoácidos H171 y E315 no afectan la estructura cuaternaria ni el contenido de metales. La variante H171C es inactiva mientras que E315A presenta kcat idéntico al de NirK pero un KM mayor. Esto podría significar que el ajuste del potencial de reducción del ion Cu2+ en el sitio activo (T2) afecta la velocidad de unión del sustrato debido a un incremento en la kET T1T2.Referencias1)Zumft, W. G., Microbiol. Mol. Biol. R., 1997, 61, 533-616.2)Averill, B. A., Chem. Rev., 1996, 96, 2951-2964.