Detección directa de enzimas β-lactamasas en enterobacterias por MALDI-TOF

FIGUEROA ESPINOSA ROQUE A; COSTA, AGUSTINA; CEJAS DANIELA; GHIGLIONE BÁRBARA; VAY CARLOS; GUTKIND GABRIEL; DI CONZA JOSÉ

Buenos Aires

Congreso; VIII Congreso SADEBAC; 2018

AAM

Introducción: La propagación de la resistencia a β-lactámicos, principalmente por β-lactamasas plasmídicas [carbapenemasa (KPC-2), BLEE (CTX-M-) y AmpC (CMY-2)], plantea una gran amenaza para la salud pública, y hace necesario desarrollar metodologías para su detección, que sean rápidas, reproducibles y fácilmente aplicables en la rutina del laboratorio de bacteriología clínica. El uso de MALDI-TOF es una alternativa innovadora para detección de resistencia. En este trabajo propusimos aplicar una metodología fácil y rápida para la detección directa de diferentes β-lactamasas de relevancia clínica.Materiales y Métodos: El estudio incluyó 166 aislamientos clínicos de diferentes especies del orden Enterobacterales [K. pneumoniae (Kpn 71), E. coli (Ec 46), E. cloacae (Ecl 14), S. enterica (Sen 15), S. marcescens (Sm 12), P. mirabilis (Pm 5) y C. braakii (Cbra 3)]. Se realizaron ensayos de sensibilidad según CLSI. Posterior al análisis por PCR y secuenciación, los aislamientos fueron agrupados de acuerdo a presencia de β-lactamasas. La detección de la proteína madura de enzimas KPC-2, CTX-M-grupo-9 (Gp9), grupo-1 (Gp1), grupo-2 (Gp2) y CMY-2 se realizó por MALDI-TOF, en un rango de masa entre 17000 - 50000 Da, a partir de colonia, posterior a un proceso rápido de extracción de proteínas con solventes orgánicos. Los espectros se adquirieron con el sistema MALDI Biotype y analizados con el software flexAnalysis. Como control positivo se usaron 5 cepas recombinantes, 4 E. coli XL1Blue, productoras de CTX-M-9, CTX-M-15, CTX-M-2, CMY-2 y 1 E. coli TOP10 productora de KPC-2. Como control negativo se usaron 37 aislamientos sensibles o productores de otras BLEE.Resultados: 56 aislamientos [Kpn (41), Ecl (7), Ec (4), Sm (4), Cbra(1)] se caracterizaron como productores de KPC-2; 52 productores de CTX-M- [(Kpn Gp9(1)/Gp1(12)/Gp2(7), Ec Gp9(6)/Gp1(6)/Gp2(7), Sm Gp2(2), EclGp1(2), Sen Gp9(4)/Gp2(4), Pm Gp2(2) y 21 productores CMY-2 [(Kpn. (1), Ec (10), Ecl (2), Sen (2), Pm (1). Posterior al procesamiento de las cepas recombinantes E. coli XL1Blue y E. coli TOP10 se detectaron 5 picos distintivos, uno por proteína, aproximadamente 28477, 27950, 28093, 28287 y 39854 Da, acorde al peso teórico de las proteínas maduras KPC-2, CTX-M-9, CTX-M-15, CTX-M-2 y CMY-2, respectivamente. Los picos distintivos de las β-lactamasas estuvieron presentes en cada uno de los espectros de los aislamientos productores de KPC-2, CTX-M-9, CTX-M-15, CTX-M-2 y CMY-2 y ausentes en los controles negativos. Es destacable que en 19/56 aislamientos productores de KPC-2, se detectó la expresión simultánea de BLEEs tipo CTX-M- [Gp1 Kpn (8), Ecl (1)]; Gp2 [Kpn (5), Sm (3)] y Gp9 [Ec (2)].Conclusiones: El protocolo desarrollado usando MALDI-TOF, detectó rápida (30 min) y confiablemente la producción de diferentes β-lactamasas en especies del orden Enterobacterales. Se logró para esta técnica una sensibilidad y especificidad del 100%. La estandarización de este protocolo permitirá automatizar la detección y caracterización de marcadores de resistencia, ampliando el uso del MALDI-TOF más allá de la identificación microbiana.