Desarrollo nacional de un kit de ELISA para la detección de anticuerpos anti- transglutaminasa en pacientes con enfermedad celíaca

CERNY N; TOLOSA G; TAMBORENEA M I; ZUNINO SEBASTIAN; BELFORTE FIORELLA; MALCHIODI E; DE MARZI M; IACONO R

Jornada; Jornadas de ciencia, Tecnologia y extensión. UNLu; 2018

Introducción: Dada la variedad de síntomas asociados con la enfermedad celíaca (EC) se hacedificultoso obtener un diagnóstico preciso de la enfermedad. Para ello se dispone de procedimientosbasados en la detección serológica de anticuerpos específicos que junto a estudios genéticospermiten detectar pacientes de riesgo que requerirán estudios de biopsia intestinal confirmatoriade biopsia intestinal. Los anticuerpos (Acs) anti- transglutaminasa (aTg), isotipo IgA, representanuna herramienta de gran utilidad tanto para el diagnóstico como el seguimiento de estos pacientes.El screening retrospectivo de este marcador inmunológico es de importancia para establecer laincidencia poblacional de esta patología autoinmune.Objetivos: Dado que la detección de aTg se realiza empleando kits importados de alto costo, nosplanteamos reemplazar las importaciones y ampliar los datos sobre la prevalencia de EC en Argentina.Para ello nos propusimos desarrollar un kit nacional de bajo costo para la detección deAcs aTg, isotipo IgA, que posibilite un estudio retrospectivo del marcador aTg en la población enestudio.Metodología: Se clonó y expresó la proteína recombinante Transglutaminasa tisular tipo 2 (r-tTg-2), se purificó con sistemas de afinidad empleando un Tag de 6 histidinas (His6) incorporada a lasecuencia. La expresión y purificación fué monitoreada por SDS-PAGE y Western blot empleandoun anticuerpo específico. La inmovilización de la r-tTg-2 en las placas de ELISA se optimizó evaluandotiempos y concentraciones de pegado. La inmunoreactividad de la proteína fue evaluadaempleando sueros de referencia. Con el objeto de evaluar la performance analítica se procesaron350 muestras de voluntarios obtenidas en convocatorias realizadas en la localidad de Chivilcoy,empleando nuestro método en paralelo con el método comercial (Orgentec). Todos los datos einformación clínica de cada voluntario fueron cargados y almacenados en un software diseñadopara este fin. La evaluación estadística de los resultados consistió en calcular el cut-off, expresadocomo la media +3SD. Las comparaciones de los resultados obtenidos por los distintos métodos serealizaron por medio de curvas ROC.Resultados: Se clonó y expresó la rTg de 699 aa, ON a 20℃. Se purificó con concentracionescrecientes de imidazol, obteniendo una proteína pura de 79 kDa, dializada y conservada a -20℃.Se optimizó el pegado de la rTg (5ug/ml por well), los tiempos de incubación (1 h a 37℃), y ladilución sérica (1ul/100ul). Obteniendo el valor de 80 muestras en simultáneo. El valor de cortedel método fue establecido procesando 200 muestras de individuos negativos para EC y sin otrapatología autoinmune. Se obtuvo un valor de sensibilidad de 0.727% y especificidad de 0.944%. Elenzimoinmunoenzayo (ELISA) desarrollado para la detección de anticuerpos anti-Tg, fue denominadoCELISAR (CElíacos-ELISA-ARgentino).Conclusiones: Se logró la puesta a punto de un kit nacional para la determinación de aTg IgA,importante en el diagnóstico y seguimiento de EC. Contar con un gran número de muestras devoluntarios nos permitió comparar la performance analítica de CELISAR frente a los ELISAs comercialesempleados. La implementación de CELISAR, de menor costo que los importados, permitiráque un mayor número de pacientes accedan al diagnóstico y obtener así, a partir de estudios epidemiológicos,datos certeros de referencia en el país.