Activación persistente de la vía de señalización de PI3K/Akt/mTOR en papilomas cutáneos caninos

SANZ RESSEL, B.L., BARBEITO, C.G., MASSONE, A.R

La Plata

Congreso; RAPAVE Reunión Argentina de Patología Veterinaria 2018; 2018

Los papilomas cutáneos (PC) son lesiones proliferativas epidérmicas comunes en los caninos, asociadas con la infección por el virus del papiloma canino. Aunque la mayoría de los PC tienen un comportamiento benigno y sufren regresión espontánea, las lesiones múltiples o la falta de regresión pueden causar problemas graves en algunos pacientes. Entre las moléculas cuya actividad está desregulada durante el proceso de carcinogénesis, diferentes modelos murinos han demostrado que la activación persistente de la vía de señalización fosfatidilinositol3-quinasa/Akt/objetivo de la rapamicina en mamíferos (PI3K/Akt/mTOR) tiene un papel central en el desarrollo y progresión de los PC. En el presente estudio se evaluó el patrón de expresión por inmunohistoquímica (IHQ) de diferentes moléculas implicadas en la vía de señalización PI3K/Akt/mTOR en secciones de una micromatriz de tejidos (MMT) construida a partir de 41 muestras de PC caninos. Para ello, se recuperaron los bloques de tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina correspondientes a PC caninos de los archivos del Laboratorio de Patología Especial Veterinaria, FCV, UNLP (periodo 2006-2014). Sobre cada una de las secciones coloreadas con hematoxilina y eosina (H-E), correspondiente a cada muestra, se realizó la marcación de las áreas de tejido de interés para la posterior construcción de la MMT utilizando un marcador indeleble bajo observación microscópica. El método utilizado en la construcción de la MMT fue el descripto por Hewitt (2004), utilizando un arrayer de tejido semiautomático (TM Arrayer TM, Pathology Devices, Inc.) y un diámetro de núcleo de 1 mm. Una vez finalizada la MMT, se obtuvieron secciones de 5 μm que fueron coloreadas con H-E y, posteriormente, nuevas secciones de 5 μm para IHC. La IHC se realizó utilizando anticuerpos primarios contra pEGFRTyr1068 (EGFR fosforilado en Tyr1068; Biocare Medical), pAktSer473 (Akt fosforilado en Ser473; Cell Signaling Technologies), pS6Ser235/236 (S6 fosforilado en Ser235/236; Cell Signaling Technologies), Ki-67 (Ki-67; Dako), y PTEN (PTEN; Biocare Medical). Para el revelado se utilizaron anticuerpos secundarios biotinilados y el complejo de avidina-biotina o fosfatasa alcalina, utilizando como cromógenos 3,3´-diaminobenzidina/Deep Space Black o Warp Red, respectivamente. Todas las secciones se escanearon a 400x usando el Aperio CS ScanScope (Leica Biosystems Imaging Inc.) y se cuantificaron usando los algoritmos de análisis de imágenes disponibles en el software ImageScope (Leica Biosystems Imaging Inc.). La evaluación histológica mostró una buena calidad de las secciones de la MMT, solo 5/41 (12,19%) de los núcleos de PC debieron ser excluidos análisis posteriores debido a su daño o pérdida durante el procesamiento. La evaluación IHQ reveló un elevado número de células epidérmicas positivas para todas las proteínas de la vía PI3K/Akt/mTOR analizadas, excepto para PTEN. La inmunomarcación de pEGFRTyr1068 mostró una tinción de la membrana y, ocasionalmente, citoplasmática limitada a las células de los estratos basal y espinoso en 26/36 (72,22%) de los PC. pAktSer473 se expresó en el citoplasma y en el núcleo de las células del estrato basal y espinoso en 36/36 (100%) de los PC, mientras que se observó un patrón citoplasmático limitado a las células del estrato granuloso en los PC restantes (4/36; 11,11%). En la doble inmunomarcación Ki-67/pS6Ser235/236, pS6Ser235/236 se expresó en 36/36 (100%) de los PC restringiéndose no solo al citoplasma de las células del estrato espinoso y granuloso, sino que también de las células del estrato basal y parabasal. De hecho, muchas de las células basales y parabasales que expresaban pS6Ser235/236 coexpresaron Ki-67. Además, se observó que todos los PC que evidenciaron una expresión reducida o ausente de pEGFRTyr1068 (10/36; 27,77%) mostraron activación de la vía de señalización PI3K/Akt/mTOR, a juzgar por la inmunodetección de pAktSer473 y pS6Ser235/236. Finalmente, 12/36 (33,33%) de los PC mostraron una expresión reducida de PTEN. Cuando el porcentaje de células positivas cuantificados en los casos de PC se evaluó frente a los controles de epidermis normal, la prueba de Kruskall-Wallis mostró diferencias significativas para pEGFRTyr1068 (P < 0,01), pAktSer473 (P < 0,01) y pS6Ser235/236 (P < 0,01), pero no para PTEN (P = 0,26). Los resultados demuestran que las moléculas implicadas en la vía de señalización PI3K/Akt/mTOR se desregulan durante el proceso de carcinogénesis epidérmica en caninos. En este contexto, la sobreexpresión de pEGFRTyr1068, pAktSer473 y pS6Ser235/236, junto con la disminución de la expresión de PTEN, puede facilitar la progresión de los PC caninos mediante la desregulación de las funciones celulares clave en las que está implicada la vía de señalización PI3K/Akt/mTOR. Estos hallazgos proporcionan información valiosa que señala a esta vía de señalización como un potencial objetivo terapéutico para el desarrollo de nuevas terapias.