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Introducción Las bacterias del género Rickettsia son patógenos intracelulares obligados, cocobacilares Gram negativos, pertenecientes a la familia Rickettsiaceae, orden Rickettsiales, subdivisión α- Proteobacteria. Este género de bacterias ha sido clasificado a su vez en cinco grupos: grupo Tifus (TG), grupo de la fiebre manchada (SFG), grupo tradicional (TRG), grupo bellii (BG) y grupo canadensis (CG). En las últimas décadas se ha incrementado el hallazgo de Rickettisas con patogenicidad desconocida, muchas de ellas aisladas de garrapatas. Algunas de estas bacterias anteriormente no eran consideradas de riesgo, sin embargo, recientemente han demostrado ser patógenas para humanos, tal es el caso de las Rickettsias pertenecientes al SFG R. slovaca, R. aeschlimannii, R. massiliae y R. monacensis en Europa. En varios países de América del Sur han sido recientemente descubiertas nuevas enfermedades transmitidas por garrapatas causadas por rickettsiales del grupo SFG. Incluso, se han reportado brotes familiares con un alto porcentaje de casos fatales, especialmente en áreas con condiciones sanitarias deficientes dado que en general, la probabilidad de emergencia de casos de rickettsiosis está asociada a factores ambientales y ecológicos y a situaciones de vulnerabilidad socio-económica. El objetivo del presente trabajo fue la identificación de bacterias del género Rickettsia, potencialmente patógenas, presentes en garrapatas de la especie Rhipicephalus sanguineus, recolecatadas de perros del barrio Los Piletones de Villa Soldati, Ciudad de Buenos Aires. Materiales y Métodos En el marco del proyecto ?Un Mundo una Salud, Prácticas Pre-Profesionales Solidarias en áreas de riesgo sanitario de Villa Soldati?, se llevaron adelante durante el año 2013 actividades de diagnóstico, prevención y control de enfermedades zoonóticas. El barrio Los Piletones de Villa Soldati, se encuentra ubicado en la Región Sur de la Ciudad de Buenos Aires, dentro de la comuna 8. Este barrio ha sido declarado en ?riesgo sanitario? desde el año 2006 por el gobierno de la ciudad. Ente las actividades que se desarrollaron, se recolectaron muestras de garrapatas R. sanguineus (garrapata común del perro) de los caninos que acudieron al servicio veterinario durante los meses de Octubre, Noviembre y Diciembre del año 2013. Las garrapatas provenientes de un mismo animal fueron clasificadas en 2 grupos discriminando únicamente entre machos y hembras. Para realizar la extracción de ADN a partir de las garrapatas, se procedió a pulverizarlas con nitrógeno líquido en mortero, luego se agregó 1 ml de Buffer de lisis y Proteinasa K a una concentración final de 100 ug/ml. Esta solución se incubó a 56 °C durante 12 hs. Pasado este tiempo se procedió a realizar la extracción del ADN por el método de fenol-cloroformo. Para realizar la identificación y correcta clasificación de las bacterias del género Rickettsia se procedió a amplificar el fragmento de cuatro genes que permiten distinguir las distintas especies del género. En primer término y a fin de identificar a las muestras de garrapatas positivas a Rickettsias, se amplificó un fragmento del gen que codifica para la enzima citrato sintasa (gltA),. A continuación, sobre las muestras positivas, se efectuó una segunda reacción de PCR que permite distinguir al grupo de la fiebre manchada (SFG) a través de la detección de una región del gen ompA, que codifica para la proteína de membrana externa de 190 KDa, específica de este grupo. A fin profundizar la caracterización de la especie de Rickettsia, a las muestras positivas, se les realizaron dos ensayos de PCR adicionales, una de ellas haciendo blanco en el gen htrA (gen de la proteína antigénica de membrana externa de 17kDa) y la otra en el gen ompB (proteína de membrana externa B). Las reacciones se realizaron en un volumen final de 50 ul utilizando la ADN Polimerasa GoTaq (Promega). Los productos amplificados de los cuatro genes fueron visualizados mediante la técnica de electroforesis en un gel de agarosa al 1% sembrando 5 µl del producto de PCR. Los 45 ul restantes de las reacciones positivas fueron enviados a secuenciación a fin de efectuar los estudios de similitud que permitieron la identificación inequívoca de la especie de Rickettsia. Para el análisis de las secuencias se utilizó el programa Vector NTI Advanced 9 para el ensamblado y BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para la comparación contra la base de datos GenBank. Resultados Con el criterio propuesto para agrupar las garrapatas, se conformaron 15 pooles. Tres de los 15 pooles resultaron positivos a las reacciones de PCR para los genes gltA, htrA, ompA y ompB. De estos tres pooles, dos correspondían a hembras adultas Teleoginas y uno a machos. Las muestras positivas de los genes ompA, ompB y htrA fueron enviadas a secuenciar. Los archivos conteniendo los electroferogramas provenientes del Servicio de Secuenciación se recibieron en formato .ab1. Se construyeron los contigs y se verificó manualmente la calidad de los electroferogramas. Posteriormente y utilizando la herramienta BLAST, se compararon los archivos en formato FASTA contra las bases de datos GenBankdel NCBI (National Center for Biotechnology Information) y se obtuvo para los tres genes analizados un 100% de identidad con las secuencias correspondientes a los mismos genes de R. massiliae en las muestras de los tres pooles. Discusión En el presente trabajo se reporta la identificación molecular de R. massiliae en garrapatas de la especie R. sanguineus que se encontraban parasitando caninos en el barrio en ?riesgo sanitario? Los Piletones de Villa Soldati. Esta especie de Rickettsia es considerada patógena para humanos. Si bien R. sanguineus tiene preferencia por alimentarse de caninos, y los reportes de picaduras a humanos por parte de esta especie de garrapata son raros, se ha verificado que todos los estadios de R. sanguineus parasitan humanos. Por lo antedicho, los resultados de este trabajo ponen en evidencia el potencial riesgo sanitario para la comunidad ante la exposición a la garrapata común del perro. El análisis a futuro del comportamiento alimenticio de las garrapatas, a través del análisis de las blood meals, permitirá determinar la diversidad de hospedadores mamíferos a fin de contribuir a programas de vigilancia epidemiológica para la prevención de ocurrencia de casos de rickettsiosis humana.

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