Análisis de la dinámica de las mutaciones asociadas a resistencia a antivirales en el virus hepatitis B por pirosecuenciación ultraprofunda

SEDE M1,2, OJEDA D1,2, CASSINO L1,2, WESTERGAARD G3; VAZQUEZ M3 QUARLERI J1,2

Congreso; X Coongreso Argentino de Virología; 2011

Análisis de la dinámica de las mutaciones asociadas a resistencia a antivirales en el virus hepatitis B por pirosecuenciación ultraprofunda Sede M1,2, Ojeda D1,2, Cassino L1,2, Westergaard G3; Vazquez M3 Quarleri J1,2   1Centro Nacional de Referencia para el SIDA 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas 3 Instituto de Agrobiotecnología Rosario (INDEAR)   Introducción: Para el tratamiento actual de la infección crónica por el virus de hepatitis B (HBV) se dispone de 5 análogos de núcleos(t)idos: lamivudina (LMV), adefovir (ADV), telbivudina (LdT), tenofovir (TDV) y entecavir (ETV). La eficacia de la terapia es limitada debido a la selección de mutantes de resistencia generadas durante la replicación viral. Técnicamente la detección de mutaciones asociadas a resistencia se basa en la secuenciación directa del producto de PCR del gen pol o en ensayos comerciales basados en hibridación reversa. La dificultad de detectar variantes virales minoritarias (abundancia relativa <20%) y nuevas mutaciones asociadas a resistencia son, respectivamente, limitaciones de dichas técnicas. La técnica alternativa de la pirosecuenciación ultraprofunda (UDPS) permite la secuenciación de múltiples variantes genéticas presentes entre las cuasiespecies virales. Objetivo: Analizar la dinámica en el tiempo de mutaciones en el gen pol de HBV asociadas a resistencia a análogos de nucleótidos ante la presión de selección ejercida por la terapia antiviral en pacientes infectados con HBV y coinfectados con HIV. Métodos: A partir de 4 pacientes crónicamente infectados por HBV (2 de ellos coinfectados con HIV) se obtuvieron 2 muestras de suero consecutivas temporalmente separadas por 1 (HIV-coinfectados) y 3 (HBV monoinfectados) años; en todos los casos la primera se obtuvo en ausencia de terapia anti-viral. En cada una se realizó la extracción de ADN, amplificación de una porción de gen pol y posterior secuenciación empleando UDPS según el protocolo 454 (Roche Diagnostics) con una profundidad promedio de 500 lecturas/ muestra. Seguido de inspección visual en búsqueda de mutaciones asociadas a resistencia. Se evaluaron los niveles de carga viral (CV) de HBV  (rango: 20 IU/mL -1.7E+08 IU/mL; Cobas Taqman, Roche). Resultados: La prevalencia de mutaciones asociadas a resistencia en el gen pol de HBV resultó inferior al 5% tanto en pacientes mono comocoinfectados en las muestras basales. Se detectaron mutaciones de resistencia primaria (A181T/V, T184A y M204V/I) y secundaria (L180M, S202G y V214A). Tras instaurarse la terapia, en los pacientes monoinfectados pudo advertirse la fijación de las mutaciones de resistencia a ETV o LMV, alcanzando una abundancia relativa superior al 80% y CV > 1000 UI/ml tras 3 años de terapia. En los pacientes coinfectados con HIV no se verificó la fijación de mutaciones de resistencia con CV de niveles indetectables (<20 UI/ml) tras 1 año de terapia. Conclusiones: La disponibilidad de UDPS para el análisis de las cuasiespecies de HBV ha permitido detectar mutaciones asociadas a resistencia con precocidad dada la baja abundancia relativa (o “poblaciones minoritarias”).  Éstas ante la presión de selección ejercida por drogas anti-virales surgieron en el tiempo y se establecieron como constituyentes mayoritarios de la población viral dependiendo de la duración de la terapia. La coexistencia del HIV puede impactar dado el uso de drogas antiretrovirales que pueden presionar a la población viral de HBV.