EVALUACIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO Y PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN OVOCITOS PORCINOS VITRIFICADOS-ATEMPERADOS

DANIELA PINCHETTI; AILÉN APARICIO; PABLO CETICA; GABRIEL ÁLVAREZ; SERGIO MORADO

Buenos Aires

Jornada; Jornadas de Jóvenes Investigadores en Ciencias Veterinarias; 2017

El objetivo del plan de beca CINconsiste en evaluar la calidad de ovocitos porcinos madurados in vitro vitrificados por el método demínimo volumen Cryotech®, cuantificando luego delatemperado la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y el nivel de peróxidode hidrógeno (H2O2). Los ovarios se obtuvieron de hembrasporcinas faenadas. Los complejos ovocito-cúmulus (COCs) inmaduros se obtuvieronpor aspiración de folículos ováricos antrales y seleccionados bajo lupaestereoscópica. Los COCs rodeados por un cúmulus denso e íntegro fueron  madurados en medio 199 con sulfato degentamicina, fluido folicular porcino, FSH y LH, bajo aceite mineral a 39°C, 5% CO2 enaire y 100% de humedad durante 48 hs y luego denudados de forma mecánica conpipeta Pasteur fina previa incubación con hialuronidasa. Los ovocitos fueronvitrificaron (n=95) utilizando crioprotectores permeables (etilenglicol,dimetilsulfóxido), componentes osmóticamente activos (trealosa) y como soporteuna lámina fina para ingresar directamente al Nitrógeno líquido. Para suatemperado se utilizaron soluciones de trealosa en concentraciones decrecientesen sucesivos pasajes hasta llegar a soluciones isotónicas. Para medir ROS seincubaron en PBS adicionado con polivinilalcohol (PVA) y 2?,7?-diclorodihidrodiacetato defluoresceína (DCHF-DA). Para evaluar la actividad de esterasas un grupo deovocitos fue incubado en PBS adicionado con PVA y diacetato de fluoresceína(FDA). Se obtuvieron microfotografías digitales con un microscopio deepifluorescencia, las imágenes se analizaron utilizando el software IMAGE J. Alser los niveles de fluorescencia de DCHF-DA dependientes de la actividad deesterasas intracelulares, el cociente entre la luminosidad obtenida por DCHF-DApara cada ovocito y el promedio de luminosidad por FDA de cada tratamiento fueconsiderado como medida relativa del nivel de ROS producido por cada ovocito.Se evaluó la producción de ROS a 0, 3 y 21 hs utilizando como controlesovocitos maduros no sometidos al proceso de vitrificación-atemperado. Laproducción de ROS fue significativamente mayor a tiempo cero, decreciendo tantoa tiempo 3 como 21hs en frescos y en vitrificados-atemperados (P<0.05). Enlos vitrificados-atemperados fue significativamente mayor en cada uno de los tiempos(P<0,05). El proceso de vitrificación-atemperado aumentaría la producción deROS de los ovocitos porcinos y dicho aumento disminuiría pero no se compensaríaen el tiempo de recuperación. A futuro, se continuará determinando el H2O2mediante el reactivo Amplex Red. El H2O2 es una de lasROS más frecuentes, por lo tanto, esperamos que presente un comportamientoanálogo a los niveles de ROS en el tiempo.