Desarrollo de ensayos de Luminex y PCR en Tiempo-Real para la tipificación de Trypanosoma cruzi

DUFFY T; SCHIJMAN A.G; DA SILVA ALEXANDRE

Santa Fe

Congreso; XXIII Reunion Científica Anual de la Sociedad Argentina de Protozoologia; 2009

Sociedad Argentina de Protozoologia

En este trabajo presentamos el desarrollo de nuevas estrategias de tipificación molecular utilizando las metodologías Luminex y PCR en Tiempo-Real con sondas Taq-Man para discriminar entre los tres grupos de Trypanosma cruzi, originalmente denominados zimodemas. Ambos ensayos combinan la sensibilidad de la PCR con la especificidad de la hibridización de sondas específicas para la discriminación de las poblaciones de T. cruzi. Sondas y primers complementarios a secuencias específicas de la región intergénica del mini-exón de cada grupo, fueron diseñados a partir del alineamiento de 26 secuencias representativas de la heterogeneidad genotípica de T. cruzi, disponibles en el Gene Bank. Los tractos con estructura secundaria estable fueron descartados para el diseño de sondas. La amplififcacion se realiza por PCR Multiplex utilizando un primer forward común y primers reverse específicos de cada grupo. Los amplicones obtenidos son distinguidos mediante la utilización de sondas específicas por Luminex o PCR en Tiempo-Real. El Luminex es una metodología novedosa que permite acoplar microesferas con concentraciones distintas de dos colorantes a oligonucleotidos o proteínas para la detección especifica de diversos analitos. Las microesferas son reconocidas por dos detectores láser utilizando tecnología análoga a la citometría de flujo, lo que permite discriminar entre 100 microesferas distintas, cada una pudiendo reconocer un analito distinto. En nuestro ensayo hemos diseñado y evaluado 10 sondas distintas para reconocer secuencias específicas del mini-exon de los grandes grupos de T. cruzi, así como una secuencia heteróloga clonada en un plásmido utilizado como control interno para descartar falsos negativos. El poder de esta tecnología radica en la capacidad del análisis simultáneo de un gran número de muestras y genotipos y su automatización. Las sondas diseñadas para el ensayo de Luminex que mejor afinidad presentaron por el amplicón especifico de cada grupo de T. cruzi, fueron modificadas para la detección de los mismos amplicones  por PCR en Tiempo-Real utilizando sondas Taq-man. La especificidad de las sondas diseñadas para cada uno de los ensayos han sido evaluadas utilizando ADN de cultivos de stocks de referencia para cada grupo de T. cruzi. La sensibilidad ha sido evaluada en muestras de sangre reconstituida, obteniendo un limite de detección de 5 parasitos/mL para ambos ensayos. .  El objetivo final de este enfoque es el análisis directo de muestras biológicas, que será puesto en marcha una vez se optimicen las condiciones de mayor sensibilidad analítica y poder resolutivo de ambas metodologías actualmente en evaluación..