ESTUDIO DE LA DINÁMICA DE ASOCIACIÓN DE PROTEÍNAS POR TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA DE ALTA RESOLUCIÓN

MORALES VÁSQUEZ, MIGUEL; ARTZ, EDUARDO; TEDESCO, LUCAS; ARAMENDÍA, PEDRO F; SZALAI, ALAN

Cordoba, Villa Carlos Paz

Congreso; XX CAFQI; 2017

Universidad de Río Cuarto

El estudio de la asociación molecular de proteínas, con marcación específica de cada una, por microscopia STORM de resolución espacial nanométrica[1], con seguimiento de su evolución temporal. Este proyecto se inscribe en una colaboración con el IBioBA-MPSP para estudiar el efecto de RSUME en la desregulación de la proteína pVHL que conduce a la tumorogénesis.La técnica STORM, de súper resolución, requiere que los fluorórforos utilizados puedan encenderse y apagarse (blinking). Los primeros ensayos desde el punto de vista fotofísico se orientaron a detectar el blinking de los fluoróforos con que marcaremos las proteínas. (Figura 1). Estas se expresaron con las marcas SNAP y CLIP (Para SNAP, se utilizó el plásmido control: pSNAPf-Cox8A y para CLIP: el plásmido control: pCLIPf-H2B), en los que se usaron tres rodaminas modificadas con una funcionalidad que permite unirlas covalentemente a ellas, para luego insertarlas a líneas celulares para realizar el control positivo (Cos7 y CHO-K1). (La Figura 2 muestra la estructura general de los colorantes). Concretamente se usaron 505-Start, TMR y SiR-647 con máximos de emisión a 532, 580 y 661 nm, respectivamente (Figura 3). En un microscopio de campo amplio se obtuvieron las secuencias de imágenes en células del tipo Cos7, marcando la proteína SNAPf-Cox8A (para el caso de SNAP) y en la histona, H2B, para el caso de CLIP) con los tres fluoróforos. Para cada uno de ellos, se analizó la distribución de tiempos de encendido, de la intensidad por cuadro y del número total de fotones emitido en cada evento de encendido También pudimos realizar reconstrucción de imágenes por STORM.