Oxidación fotosensibilizada de aductos de Rosa de Bengala con Albúmina Sérica Bovina

NATALIA M. ARGAÑARAZ, M. BEATRIZ ESPECHE TURBAY, VALENTINA REY Y CLAUDIO D. BORSARELLI

San Miguel de Tucumán

Congreso; Séptimo Encuentro Nacional de investigadores en Temas Relacionados con Sustancias Peroxídicas; 2012

Introducción El oxígeno molecular (3O2) es necesario para la vida, pero en determinadas condiciones de estrés a nivel celular puede generar un desbalance en la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO), como anión superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2), y oxígeno singulete molecular (1O2), capaces de reaccionar y modificar oxidativamente a biomoléculas funcionales (lípidos, ADN y proteínas), y, consecuentemente producir daño y/o muerte celular. Actualmente existe un gran interés en el mecanismo y en las consecuencias biológicas del daño ocasionado por especies radicalarias y no radicalarias sobre las macromoléculas, como las proteínas . En particular, la oxidación de proteínas resulta en pérdidas severas de la funcionalidad biológica debido a cambios estructurales y/o conformacionales de la proteína nativa, por ejemplo alteración de la susceptibilidad a la proteólisis, disminución de la actividad enzimática, modificación de los residuos de aminoácidos, entrecruzamiento intra- o intermolecular, etc. En particular, el 1O2 se genera en sistemas biológicos tanto por procesos endógenos (reacciones enzimáticas y bioquímicas) como así también por estímulos exógenos, tales como exposición a la luz UV-visible de moléculas sensibilizadores (ej. porfirinas, vitamina B2, co-factores enzimáticos, moléculas de colorantes, etc) . En el caso de la generación fotosensibilizada de 1O2, hay que considerar además que las proteínas presentan diversos sitios con propiedades locales apropiadas para la interacción y asociación de moléculas sensibilizadoras. Este fenómeno, puede modificar las rutas fotofísicas y fotoquímicas del sensibilizador, y por ende el mecanismo de foto-oxidación de la macromolécula3. Por tanto, existe un marcado interés en analizar tanto la interacción sensibilizador-proteína como el mecanismo de fotosensibilización de los aductos formados. Objetivos En este trabajo hemos estudiado la formación del aducto entre la albúmina sérica bovina (BSA) y el colorante xanténico Rosa de Bengala (RB), y caracterizado la oxidación fotoinducida de BSA en función de la relación molar colorante/proteína, mediante la utilización de espectroscopía de absorción UV-Vis y de fluorescencia, como también mediante técnicas analíticas y bioquímicas. Resultados La asociación de la RB con BSA se caracterizó mediante técnicas de absorción y fluorescencia en soluciones de buffer TRIS-HCl 20 mM a pH 7,4. La respuesta espectral del colorante en función de la concentración de proteína indicó que RB se asocia fuertemente a la proteína con una constante de asociación KA =0,5 M-1, y que el colorante se incorpora a un sitio de la proteína cuyas propiedades son menos polares que el buffer de la solución. La irradiación con luz verde (560  30 nm) de soluciones acuosas saturadas con aire del aducto RB-BSA en relaciones molares de RB (10 M fija):BSA 1:1, 1:5, 1:10, mostraron cambios espectrales de absorción y fluorescencia de la proteína, que sugieren la formación progresiva de productos de oxidación de Trp1, y otros aminoácidos oxidables como Met, His, Cys y Tyr, confirmado por el consumo de O2 disuelto y el aumento concomitante de la concentración de grupos carbonilos formados2. Estos productos de oxidación presentan un máximo de absorción entre 320-340 nm y máximo de fluorescencia  410 nm. El agregado del ion azida N3-, un eficiente desactivador de 1O2, redujo notoriamente estos cambios sugiriendo que este ERO es la especie intermediaria de la oxidación. Además, la modificación oxidativa de BSA, el consumo de oxígeno disuelto y la velocidad de blanqueo de RB fue mayor para el aducto 1:10 que 1:5 y 1:1, reflejando que la eficiencia de generación de 1O2 disminuye con la concentración intraproteica de colorante. Por otra parte, la formación de peróxidos libres y consumo total de RB fue independiente de la relación colorante:proteína, sugiriendo la participación de O2- en el blanqueo del colorante. Conclusiones Los resultados observados pueden ser explicados por la combinación de procesos de fotosensibilización del tipo I y II (es decir, transferencia de electrones y de energía, para formar O2- y 1O2 como intermediarios ERO respectivamente). La formación de productos de oxidación fluorescentes y el aumento en la concentración de carbonilos de los diferentes aductos son mediados por 1O2 (mecanismo Tipo II), mientras que la generación de H2O2 libres y blanqueo de RB es intermediado por O2- (mecanismo tipo I). De esta manera podemos concluir que los procesos de fotosensibilización in vitro es una metodología apropiada para el estudio de oxidación de proteínas e interpretar los cambios de estrés oxidativo llevados a cabo en las proteínas dentro de los medios biológicos.