Desarrollo de un método para purificación de proteínas recombinantes por cromatografía de afinidad utilizando matrices de peptidoglicano.

VIZOSO-PINTO, MARÍA GUADALUPE; PADILLA FRANZOTTI, CARLA; RAYA TONETTI, MARÍA FERNANDA; ARCE, LORENA

san miguel de tucuman

Simposio; V Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2018

IntroducciónEl motivo lisina (LysM) es un motivo ubicuo en todos los reinos. En bacterias permite que enzimas que degradan la pared celular se unan no covalentemente al peptidoglicano. Esta propiedad ha sido explotada para diseñar vacunas mucosales que consisten en proteínas recombinantes marcadas con LysM ancladas a partículas similares a bacterias (BLP) como vehículos. Sorprendentemente, no se aplicó el motivo LysM como etiqueta para la purificación de proteínas recombinantes. Por lo tanto, nuestro objetivo fue desarrollar un método de purificación de proteínas recombinantes por cromatografía de afinidad aprovechando la propiedad de los dominios LysM de unirse al peptidoglicano.MetodologíaLas BLP se obtuvieron tratando cultivos de 16 hs de lactobacilos con ácido y calor. Para seleccionar la mejor matriz de unión, se generaron BLP de 4 especies diferentes de lactobacilos, se verificaron mediante microscopía electrónica de transmisión. Se transformó por shock térmico E. coli Rossetta con pETG-N-His-Venus-LysM5 y se indujo con IPTG la expresión de Venus (proteína fluorescente reportera) etiquetada a LysM. Los lisados bacterianos se pusieron en contacto con las BLP, se optimizaron los tampones de lavado y de elución y se siguió paso a paso el proceso mediante SDS-PAGE y tinción con Coomasie Blue. Resultados y discusión La etiqueta LysM permitió unir la proteína Venus a la matriz de peptidoglicano como se observó en SDS-PAGE. Venus no pudo ser eluída con cambios en la fuerza iónica del buffer ni con cambios de pH (2,5 a 9). Finalmente, la proteína pura pudo eluir en buffer 8M de urea. Conclusiones Desarrollamos un método para purificar proteínas empleando el motivo LysM y una matriz económica, obteniendo rendimientos similares al sistema NiNTA. Las proteínas purificadas obtenidas en condiciones desnaturalizantes, podrían ser usadas como antígenos para tests de diagnóstico o ser renaturalizadas por diálisis para otras aplicaciones.