DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN KIT DE ELISA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEOSPOROSIS BOVINA

FC MANSILLA; I GUAL; MS PÉREZ-AGUIRREBURUALDE; NP CARDOSO; ME QUINTANA; AV CAPOZZO

Encuentro; AAVLD; 2016

La neosporosis bovina es considerada como una de las principales causas de síndrome reproductivo en bovinos, causando importantes pérdidas económicas en rodeos de leche y de carne1. En Argentina el diagnóstico de la neosporosis bovina se realiza mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) mientras que el ELISA es la prueba más utilizada a nivel mundial. Dado que no existen kits de ELISA de industria nacional, el alto costo que implica la importación de estos reactivos vuelven imposible la utilización de esta técnica de manera rutinaria en los laboratorios de diagnóstico. El objetivo de este trabajo fue desarrollar y validar un kit de ELISA de bajo costo y alto rendimiento capaz de detectar la presencia de anticuerpos dirigidos contra proteínas obtenidas de taquizoítos de Neospora caninum (sNcAg) en suero bovino.Para estandarizar y optimizar el protocolo generamos un pool de sueros obtenidos de tres animales positivos (infecciones experimentales) y otro de tres animales negativos, según IFI. Los mismos fueron evaluados empleando distintas concentraciones de antígeno de captura (500, 750 y 1000 ng/pocillo), distintas concentraciones del conjugado anti IgG-bovino:HRP (1:2500, 1:5000 y 1:10000) y dos marcas diferentes de sustrato cromógeno (TMB). Se probaron además distintos tiempos de incubación tanto a temperatura ambiente como a 37°C y diferentes soluciones de bloqueo. Como resultado, en el protocolo final se indica incubar los sueros en una dilución 1:120 durante 30 minutos, utilizar el conjugado diluido 1:5000 e incubar 20 minutos (ambos pasos a temperatura ambiente). Una vez adicionado el sustrato (TMB), se incuba la placa 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. La reacción se frena agregando una solución de parada a cada pocillo, para luego leer a 450nm. Los resultados se calculan normalizando los valores de OD respecto al control positivo (S/P%). Se determinó la precisión de la técnica ensayando la repetitividad entre series dentro de una placa y entre placas por un mismo operador. Para este ensayo se seleccionó una muestra positiva débil (título IFI: 400), una positiva media (título IFI: 800), una positiva fuerte (título IFI: 1600) y una negativa. Cada una se analizó por triplicado en 5 series independientes en una misma placa. Para calcular la sensibilidad y especificidad diagnóstica (SenD y EspD, respectivamente) se analizaron 307 muestras positivas y 327 muestras negativas, de título conocido por IFI. Con los valores de S/P% se construyó una curva ROC que permitió establecer las diluciones óptimas y los puntos de corte. También se analizó la concordancia con la técnica de IFI (considerada como standard de oro).El protocolo final es muy sencillo. El suero se prepara en una única dilución, las incubaciones son cortas y se realizan a temperatura ambiente. Asimismo, el análisis de los datos es muy simple. La validación se realizó siguiendo los lineamientos del manual OIE para animales terrestres (Capítulo 1.1.4). Dentro de cada serie el coeficiente de variación para cada muestra fue menor al 10% para las 4 muestras analizadas. Lo mismo se observó entre las 5 series. Para evaluar la estabilidad de las placas envasadas se realizó una prueba de estabilidad acelerada. Las placas fueron sensibilizadas, bloqueadas, secadas y envasadas al vacío. Una de ellas se almacenó a 37°C y otra a 4°C. Luego de una semana, 20 muestras seleccionadas al azar (7 positivas y 13 negativas) se evaluaron en ambas placas. Se observa una reducción promedio de la reactividad del 26% entre los valores obtenidos con la placa conservada a 4 vs 37°C, lo que sugiere que las placas se mantendrían estables por un período de hasta 12 meses. Los sueros son diluidos 1:120. Los animales con un valor de S/P% superior al 40% son considerados positivos, mientras que los que presentan un valor menor al 30% son negativos. Los que presentan un S/P% entre 30 y 40% son considerados dudosos, y se vuelven a analizar en una dilución 1:40, esta vez con un punto de corte del 30%. En estas condiciones la sensibilidad diagnóstica es de 0.925 y la especificidad del 0.968. La concordancia con la técnica de IFI (standard de oro) fue de 0.91, con un valor coeficiente Ƙ de Cohen igual a 0.82, indicando una concordancia casi perfecta. No se observa correlación lineal entre ambas técnicas. También demostramos que mediante esta técnica es posible analizar muestras agrupadas, detectando una muestra positiva fuerte o media en hasta 100 muestras negativas. Para esto las muestras se diluyen 1:40. En este caso, la EspD y SenD alcanzan el 90%.El ELISA desarrollado cumple las especificaciones requeridas para utilizarse a nivel comercial. Permitirá realizar relevamientos y determinaciones individuales a bajo costo y en tiempos cortos, mejorando el diagnóstico local de la neosporosis bovina.