Técnica de PCR en tiempo real para Leptospira en fetos bovinos abortados espontáneamente

RECAVARREN M; QUINTANA S; MARIN M; PAOLICCHI F; ODEÓN A; MORRELL E

Buenos Aires

Congreso; 37° Congreso AAPA ? 2nd Joint Meeting ASAS-AAPA ? XXXIX Congreso de la Sociedad Chilena de Producción Animal; 2014

AAPA

Introducción La Leptospirosis es una enfermedad zoonótica causada por la bacteria Leptospira interrogans que en los bovinos puede causar infertilidad, mortandad embrionaria, abortos y/o nacimiento de animales débiles. La prueba sérica de referencia (microaglutinación en tubo; MAT) detecta anticuerpos (Ac) específicos en suero pero tiene sensibilidad limitada en fase aguda y requiere un 2° muestreo confirmatorio; además no diferencia Ac vacunales de infectantes. Otra de las técnicas utilizadas es la inmunofluorescencia directa (IFD), pero la sensibilidad de la misma depende de la experiencia del observador para identificar la bacteria en la muestra de tejido. El objetivo del trabajo fue aplicar la técnica de PCR en tiempo real para detectar ADN de Leptospira spp en tejidos de fetos bovinos abortados esponatáneamente, comparando los resultados con los obtenidos por la técnica de IFD. Materiales y métodos Diez fetos bovinos abortados con sospecha de leptospirosis fueron procesados en forma rutinaria (bacteriología, virología, histopatología e IFD) en el Servicio de Diagnóstico Veterinario Especializado INTA Balcarce. Todos los fetos presentaban lesiones histopatológicas de hepatitis periportal mononuclear y nefritis intersticial mononuclear. Las muestras fueron conservadas a -20° C para su posterior análisis por PCR en tiempo real. Se logró extraer y amplificar exitosamente ADN de las muestras de dichos tejidos utilizando como control interno una amplificación de ADN bovino. Para detectar ADN de Leptospira spp. por la técnica de PCR en tiempo real se utilizaron los cebadores LipL32-270F y LipL32-692R, que amplifican un fragmento de 423 pb, y los cebadores Lepto F y Lepto R, que generan un amplicón de 87 pb a partir de ADN de Leptospira spp. Resultados y Discusión Los resultados de los fetos positivos a IFD y PCR en tiempo real se resumen en la Tabla 1. De las diez muestras procesadas, fue posible detectar ADN de Leptospira spp sólo en 6 casos (60%) por PCR en tiempo real con los cebadores de 87 pb. Se atribuye esta falta de amplificación con los cebadores de 423 pb a los altos niveles de degradación que suelen presentar este tipo de muestras que son almacenadas y transportadas desde establecimientos alejados, en muchos casos sin la refrigeración adecuada. Por esta razón es importante para la realización de un correcto diagnóstico molecular, la utilización de cebadores que amplifiquen fragmentos pequeños de ADN para no tener resultados falsos negativos debido a la alta degradación del ADN de la muestra. Debido a que las muestras fueron tomadas de diferentes sitios anatómicos para la realización de la IFD y la extracción de ADN, probablemente sea la razón por la cual no fue posible detectar ADN de Leptospira en la totalidad de las muestras. Conclusiones Se desarrolló una técnica de PCR en Tiempo Real que detectó ADN de los serovares más comunes de Leptospira que infectan a bovinos, a partir de muestras clínicas de fetos abortados de bovinos. Se deberán realizar futuros estudios con mayor cantidad de muestras para mejorar establecer su utilidad diagnóstica. El diagnóstico de Leptospira en bovinos realizado por PCR en Tiempo Real puede ser usado como complemento de la técnica de Inmunofluorescencia directa.