OPTIMIZACIÓN DE TAQMAN REAL TIME RT-PCR PARA LA DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL EN CÉLULAS BOVINAS.

MARIN MS; PÉREZ SE; QUINTANA S; LEUNDA MR; ODEÓN AC

Mar del Plata

Congreso; Reunión Anual de SAIC - SAI 2012; 2012

SAIC - SAI

Dada la implicancia de los receptores tipo toll (TLRs) en la defensa innata del huésped, existe una necesidad creciente de optimizar las técnicas para cuantificar su expresión. El objetivo de este trabajo fue desarrollar ensayos de expresión génica de TLRs bovinos mediante Taqman Real Time RT-PCR. Inicialmente se optimizó la extracción de ARN total con Trizol a partir de células blancas sanguíneas (linfocitos 86%, neutrófilos 12%, monocitos 2%) y distintos sectores de sistema nervioso (cerebro, cerebelo, médula oblonga y ganglio trigémino) de 6 bovinos clínicamente sanos y de la línea celular de riñón bovino MDBK. El ARN extraído fue digerido con DNAsa I y se sintetizó ADNc a partir de 1 µg de ARN. Se diseñaron cebadores y sondas para los TLR3, 7, 8 y 9 bovinos utilizando el software Primer Premier y se analizaron su especificidad In Silico y las características termodinámicas mediante programas bioinformáticos. Para las amplificaciones se emplearon 800 nM de cebadores específicos, 200 nM de sonda, 1x Taqman Universal PCR Mastermix (Applied Biosystems) y 1 µl de ADNc. Se efectuaron curvas estándares para cada gen determinándose que la eficiencia de amplificación se encontraba dentro de los parámetros recomendados para realizar estudios de expresión génica. Mediante esta técnica se logró detectar la expresión de los cuatro TLRs bovinos estudiados en células blancas sanguíneas y en los distintos sectores de sistema nervioso analizados. Por el contrario, como en otras líneas celulares establecidas, las células MDBK no expresaron dichos receptores. Para corroborar la ausencia de inhibidores en la reacción de PCR se determinó paralelamente en todas las muestras la expresión del gen endógeno GAPDH. Estas nuevas herramientas moleculares serán de utilidad para el estudio de los perfiles de expresión génica de TLRs en distintos tejidos bovinos y bajo distintas condiciones fisiológicas, contribuyendo al conocimiento de la inmunidad innata contra las enfermedades del ganado.