Humanización de un fragmento de anticuerpo anti-IFN-alpha2b destinado al uso terapéutico

ATTALLAH, C; ETCHEVERRIGARAY, M; MARANHAO, A; OGGERO, M

Buenos Aires

Jornada; XII JorFyBI; 2015

INTRODUCCIÓN:Durante el último tiempo se ha demostrado la importancia del IFN-alpha en el Lupus Eritematoso Sistémico (LES). La liberación excesiva de esta citoquina por el propio organismo, influencia el desarrollo y la progresión de esta patología, e incide en las manifestaciones clínicas de la enfermedad. Existen varias líneas de investigación que relacionan al IFN-alpha como un potencial agente causante de esta enfermedad autoinmune, incluso se ha reportado que altos niveles de IFN-alpha en suero constituyen un factor de riesgo hereditario para contraer LES. Por esta razón, la terapia con anticuerpos recombinantes anti-IFN-alpha ha surgido como estrategia terapéutica frente a esta patología. La generación de líneas celulares que expresen moléculas de anticuerpos monoclonales resulta dificultosa ya que se debe co-transfectar las células con vectores que codifiquen ambas cadenas, pesada y liviana, y se debe optimizar la expresión de cada una de ellas. En cambio, las proteínas de fusión a Fc, las cuales están compuestas por las regiones variables de un anticuerpo, fusionadas por una secuencia linker, y dicha estructura fusionada a su vez a la región Fc de las inmunoglobulinas, constituyen una única cadena polipeptídica (scFv-Fc) que mantiene las propiedades de un anticuerpo completo. Los anticuerpos monoclonales y las proteínas de fusión a Fc se producen principalmente en células CHO (del inglés, Chinese Hamster Ovary), ya que se encuentran muy bien caracterizadas y poseen la capacidad de glicosilar tales moléculas en forma semejante al patrón que presentan las proteínas humanas.  Un problema asociado con los anticuerpos monoclonales radica en su potencial inmunogenicidad al ser administrados a pacientes. Considerando que los primeros anticuerpos empleados con fines terapéuticos fueron de origen murino, generados a partir de la tecnología de hibridomas, se intentaron varias estrategias para reducir el riesgo inmunogénico, como la generación de moléculas quiméricas, humanizadas y anticuerpos totalmente humanos, en las cuales se incrementa progresivamente la proporción de secuencias humanas que las constituyen. En función de estas evidencias, en el desarrollo de este trabajo nos proponemos generar moléculas anti-IFN-alpha2b del tipo scFv-Fc humanizadas, para su utilización como agentes terapéuticos en enfermedades relacionadas con un aumento excesivo de la producción endógena de IFN-alpha, como el LES. La tecnología empleada para generar estas moléculas constituye un gran aporte al sector productivo del país, ya que se refiere a la posibilidad de elaborar en Argentina un producto con superlativo contenido tecnológico.MATERIALES Y MÉTODOS:Como punto de partida se empleó una molécula del tipo scFv murino anti-IFN-alpha2b, obtenido previamente en nuestro laboratorio, cuya afinidad por el rhIFN-alpha2b es del orden de 108 M-1. Se construyó una proteína de fusión scFv-Fc mediante la adición de la secuencia codificante de las regiones [bisagra-CH2-CH3] de la cadena pesada de la IgG1 humana, mediante reacciones de PCR. Esta molécula quimérica se clonó en un vector de expresión en células de mamíferos y se incorporó por transfección en células CHO-K1, HEK293 (del inglés, Human Embryonic Kidney) y NS0 (línea celular derivada de mieloma murino). Las distintas líneas celulares fueron sometidas a un proceso de presión selectiva con concentraciones crecientes de puromicina en el medio de cultivo correspondiente a cada una de ellas, con el propósito de seleccionar las células con mayor nivel de expresión. Mediante técnica de ELISA específico indirecto se determinó la capacidad de las proteínas de fusión producidas por las distintas líneas celulares, de unir al rhIFN-alpha2b. Luego, se procedió a la humanización in silico de la porción scFv murina (Figura 1). Se analizó la mejor propuesta para el intercambio de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de una molécula humana, por las correspondientes regiones murinas, de modo de obtener la secuencia de un scFv humano cuyas regiones CDRs corresponden al scFv murino en estudio. Este scFv humanizado se fusionó al Fcg1 de la IgG humana, se clonó en un vector de expresión en células de mamífero, y se tranfectaron células CHO-K1 y HEK293, en forma transiente.RESULTADOS:Se demostró la capacidad de la molécula quimérica scFv-Fc de unir al rhIFN-alpha2b mediante técnica de ELISA específico indirecto. En la Figura 2 puede observarse que las tres líneas celulares producen anticuerpo funcional, aunque se evidencia que la transfección y/o estabilidad del transgen en las células NS0 es menos eficiente, ya que expresan menos cantidad de proteína. La secuencia scFv murina fue humanizada exitosamente. Se logró determinar su capacidad para reconocer a la citoquina de interés al ser fusionada a región Fc de las IgG humanas, clonada en un vector de expresión en células de mamíferos, y posteriormente transfectadas en forma transiente en células CHO-K1 y HEK293 (Figura 3). Este resultado se puede observar claramente en el caso de la proteína producida por las células HEK293, ya que la eficiencia de transfección de estas células es muy alta. El proceso de humanización no siempre resulta efectivo ya que es una intervención in silico de la molécula, lo cual podría redundar en la pérdida de la actividad de la proteína de interés. En este caso, la molécula generada presenta afinidad por el rhIFN-alpha2b, aunque resta la purificación de estas proteínas de fusión y la comparación de la capacidad de unir al rhIFN-alpha2b de la molécula quimérica y la humanizada.  CONCLUSIONES:La proteína de fusión scFv-Fc anti-IFN-alpha2b humanizada, generada en nuestro laboratorio, posee capacidad de reconocer a esta citoquina. Este anticuerpo humanizado resulta un potencial agente terapéutico en enfermedades relacionadas con un aumento excesivo de la producción endógena de IFN-alpha, como el LES. Como perspectiva de trabajo, se determinará la constante de afinidad de esta molécula y se decidirá si es necesario mejorar esta propiedad o las funciones efectoras del anticuerpo, teniendo en cuenta el entorno en el cual debe ejercer su función.