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IBARRA cristina Adriana

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Título:

Acción de las toxinas Shiga tipo-2 y Subtilasa en cultivos primarios de células endoteliales de la microvasculatura glomerular humana.

Autor/es:

AMARAL MARÍA MARTA; SACERDOTI FLAVIA; REPETTO HORACIO A; IBARRA CRISTINA

Lugar:

Mar del Plata

Reunión:

Congreso; LVIII Reunión Científica de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Reunión Anual 2013 de la Sociedad Argentina de Fisiología, XLV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Farmacología Experimental; 2013

Institución organizadora:

SAIC, SAFIS, SAFE

Resumen:

El Síndrome Urémico Hemolítico (SUH)asociado a diarrea es una complicación sistémica de la infección porEscherichia coli (STEC) productor de toxina Shiga (Stx) que afectaprincipalmente a niños menores de 5 años1. En Argentina, el SUH es endémico2 yes la primera causa pediátrica de insuficiencia renal aguda (IRA) y la segundade insuficiencia renal crónica en niños menores de 5 años de edad, siendoademás responsable del 20% de los trasplantes renales en niños yadolescentes3-5. La destrucción de las células endoteliales de lamicrovasculatura renal, gastrointestinal y de otros órganos y tejidos poracción de Stx es central en la génesis del SUH. Sin embargo, el daño por Stx enel endotelio renal no es suficiente para causar IRA que se observa en pacientescon SUH. Exeni et al.6, postulan que el endotelio sufre un marcado cambio haciael estado trombótico que dispara la activación y agregación plaquetaria. Lainteracción de neutrófilos y monocitos con células endoteliales activadasamplificaría la injuria renal7. Recientemente se identificó la citotoxinadenominada Subtilasa (SubAB) en cepas de STEC que producen SUH8 y se postulaque podría contribuir a la patogenia de esta enfermedad. El objetivo de estetrabajo fue estudiar la acción de Stx2 y SubAB sobre las células endotelialesde la microvasculatura glomerular humana para precisar la acción de cada una deellas y la posible cooperación de sus efectos. Las células endotelialesglomerulares humanas (HGEC) se aislaron de fragmentos de corteza de riñones pediátricosprovenientes de nefrectomías realizadas en el Hospital Nacional ?Prof.Alejandro Posadas?. La población celular analizada por citometría de flujo einmunofluorescencia, presentó un 95% de células positivas para el factor vonWillebrand y para la molécula de adhesión endotelio-plaqueta-1. Posteriormente,se analizó la presencia del receptor específico para Stx, globotriaosilceramida(Gb3)9, en la membrana plasmática de HGEC mediante inmunofluorescencia y seevaluaron cambios en su expresión por cromatografía en capa delgada (TLC) luegodel tratamiento de HGEC con un inhibidor de la síntesis del Gb3 (5 μM C9,Genzyme). La TLC de los glicolípidos extraídos de HGEC luego de la incubacióncon C-9 mostró un patrón de bandas similar al obtenido con el estándarpurificado de Gb3 aunque de intensidad menor respecto a HGEC no incubadas conC-9. Los niveles de Gb3 se cuantificaron por ensayo enzimático fluorométrico deresiduos de galactosa10. La concentración de Gb3 en HGEC incubada 48 hs con C-9fue significativamente menor comparadas con HGEC control (1.106) (0,28 ± 0,15μg vs 0,85 ± 0,20, P<0,05, n=3). A continuación, se evaluó la acción de Stx2y SubAB sobre la morfología, viabilidad, necrosis y apoptosis celular. Para losestudios morfológicos, monocapas de HGEC se incubaron con Stx2 (10 ng/ml) oSubAB (3 μg/ml) por 24 hs en condiciones de arresto de crecimiento, secolorearon con H&E y se observaron bajo microscopio óptico. Stx2 causó unadisminución significativa del número de células adheridas al soporte y unaumento del área celular en las que aún permanecieron adheridas. SubAB tambiéndisminuyó el número de HGEC adheridas pero en menor proporción que Stx2 ygeneró cambios morfológicos como elongación y aumento del área celular. Paralos estudios de viabilidad celular, HGEC se incubaron con distintasconcentraciones de Stx2 (0,001-100 ng/ml) y/o SubAB (0,15-1500 ng/ml) por 24,48 y 72 hs en condiciones de arresto de crecimiento y la viabilidad celular semidió por incorporación de rojo neutro. El control correspondió a las HGECincubadas en las mismas condiciones pero sin toxina (100% viabilidad). Stx2disminuyó significativamente la viabilidad de las HGEC respecto al control demanera dosis y tiempo dependiente. La dosis citotóxica capaz de producir el 50%de muerte celular (DC50) fue de 1 ng de Stx2/ml luego de 72 hs de tratamiento.SubAB también disminuyó significativamente la viabilidad celular con una DC50de 15 ng/ml a 150 ng/ml, n=5, *P<0,05. El tratamiento de las HGEC con Stx2 ySubAB co-incubadas no mostró diferencias significativas en la viabilidadrespecto a los tratamientos con las toxinas separadas. Para evaluar si laacción citotóxica de Stx2 y SubAB en HGEC es dependiente del receptor Gb3, lascélulas se incubaron previamente con C-9 y luego con Stx2 (10 ng/ml) o SubAB (3μg/ml). Nuestros resultados demostraron que los efectos citotóxicos de Stx2pero no de SubAB disminuyeron significativamente cuando HGEC fueron incubadaspor 48 hs con concentraciones crecientes de C-9 (0,05-5 μM, n=4, *P<0,05) locual indica la dependencia de Stx2 del receptor Gb3 como fue previamentedescripto9. Finalmente se estudiaron los posibles mecanismos de muerte celulardesencadenados por ambas toxinas sobre las HGEC. Las células fueron tratadas adistintos tiempos (4, 6 y 24 hs) con Stx2 (10 ng/ml) o SubAB (3 μg/ml) y el %de células apoptóticas y necróticas se determinó mediante coloración connaranja de acridina-bromuro de etidio. A partir del análisis morfológicorealizado por microscopia de fluorescencia se comprobó que ambas toxinascausaron necrosis y apoptosis de las HGEC. Estos resultados fueron confirmadosmediante marcación con anexina V-ioduro de propidio y análisis por citometríade flujo. Stx2 y SubAB causaron más apoptosis que necrosis en todos los tiemposestudiados, mientras que el efecto de Stx2 fue tiempo dependiente el de SubABse evidenció sólo a tiempos cortos del tratamiento. Además, Stx2 produjo másnecrosis que SubAB a las 24 hs. Nuestros resultados demuestran que ambastoxinas Stx2 y SubAB producidas por STEC pueden contribuir al desarrollo deldaño endotelial característico de la patogénesis del SUH aunque sus efectos noson aditivos ni potenciadores. Referencias bibliográficas 1. Gianantonio CA, et al. (1973)."The hemolytic-uremic syndrome". Nephron 11(2): 174-92. 2. Rivas M, et al (2010)."Diarrheagenic Escherichia coli in Argentina". In: Torres AGE,editor. Pathogenic Escherichia coli in Latin America. Bentham SciencePublishers Ltd. pag: 142-61. 3. Repetto HA. (1997). "Epidemichemolytic-uremic syndrome in children". Kidney Int. 52: 1708?19. 4. Repetto HA. 2005." Long-termcourse and mechanisms of progression of renal disease in hemolytic uremicsyndrome". Kidney Int. Suppl. 97: S102?06. 5. Ferraris, JR et al (2002)."Shiga toxin-associated hemolytic uremic syndrome: absence of recurrenceafter renal transplantation". Pediatr Nephrol 17(10): 809-14. 6. Exeni RA, et al. (2007). Role ofpolymorphonuclear leukocytes in the pathophysiology of typical hemolytic uremicsyndrome. ScientificWorldJournal. 7:1155-1164. 7. Zoja C, et al. (2010) Shigatoxin-associated hemolytic uremic syndrome: pathophysiology of endothelialdysfunction. Pediatr Nephrol 25: 2231-2240. 8. Paton AW, et al. (2004) A new familyof potent AB(5) cytotoxins produced by Shiga toxigenic Escherichia coli. J ExpMed 200: 35-46. 9. Jacewicz M, et al. (1986) Clausen H,Nudelman E, Donohue-Rolfe A, Keusch GTPathogenesis of shigella diarrhea. XI.Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLacells and its identification as globotriaosylceramide. J Exp Med 163:1391-1404. 10. Rozenfeld PA, et al. (2009) An easyand sensitive method for determination of globotriaosylceramide (Gb3) fromurinary sediment: utility for Fabry disease diagnosis and treatment monitoring.Clin Chim Acta 403: 194-197.

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