Mutantes de la subunidad B de la toxina Shiga tipo 2 (Stx2) neutralizan el efecto de la toxina nativa en cultivos primarios de células epiteliales tubulares renales humanas (CERH).

PISTONE CREYDT V, CASTRO PARODI M, TIRONI FARINATI C, SILBERSTEIN C, IBARRA C

Mar del Plata, Argentina

Congreso; LI Reunión de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica. Mar del Plata.; 2006

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

La Stx2 producida por algunas cepas patógenas de E. coli causa colitis hemorrágica en humanos que puede derivar en Síndrome Urémico Hemolítico. Esta toxina está constituida por una subunidad A y cinco B. Ambas tienen acción citotóxica en CERH. El objetivo del presente trabajo fue obtener mutantes por recombinación genética de la subunidad B de Stx2 (Stx2B) que perdieran la acción tóxica y neutralizaran el efecto de Stx2 observado en CERH. Los cultivos primarios se obtuvieron a partir de células epiteliales provenientes de corteza renal de pacientes adultos del Servicio de Urología del Hospital de Clínicas. Las mutantes se obtuvieron a partir de la la amplificación de fragmentos de la subunidad B por PCR. Una mutante (Stx2Bmut) se clonó en pQE70 y otra (Stx2Bcons) en pRSET-A que agregan 6 histidinas en el extremo C o N-terminal de la proteína, respectivamente. Luego se amplificaron en bacterias competentes DH5α o BL-21.Las mutantes se purificaron por cromatografía de afinidad usando columnas de Ni-agarosa y se analizaron por Western blot. El efecto de Stx2B, Stx2Bmut y Stx2Bcons se estudió a 24 y 48hs sobre la viabilidad de CERH. Stx2Bcons no modificó la viabilidad de las células hasta concentraciones tan altas como 10μg/ml y 48hs de incubación. En cambio, Stx2Bmut modificó la viabilidad de CERH (p<0,05) a 24 hs pero a una concentración 10 veces mayor que Stx2B. A continuación se evaluó la capacidad que tenían ambas mutantes de neutralizar el efecto tóxico de Stx2 sobre CERH. Una neutralización total se logró cuando las células se incubaron con 1ng/ml de Stx2Bmut o Stx2Bcons por 4hs y luego con 1ng/ml de Stx2 por 20hs. Este bloqueo fue parcial cuando las células se lavaron luego de la preincubación con las mutantes. Los resultados demuestran que ambas mutantes son capaces de neutralizar el efecto citotóxico de la toxina, siendo Stx2Bcons totalmente inocua para las células a concentraciones y tiempos de incubación elevados.