Estudio de la activación de la vía extrínseca de apoptosis por el virus de arteritis equina en distintos cultivos celulares

METZ G; ABEYÁ MM; M.S SERENA; PANEI C.J.; BARRANDEGUY, M.; ECHEVERRÍA M. G., IGLESIAS M. E.; VISAN, A.; METZ, G. E.; LA TORRE, J. L.; BECERRA, L.; SERENA, M. S.; TORDOTA, M. S.; GONZALEZ, R. J.

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología.; 2017

Asociación Argentina de Virología

Introducción: Existe una gran variedad de virus animales que modulan el mecanismo de apoptosis celular en los cultivos infectados ya sea mediante la activación de la vía intrínseca, extrínseca o la vía del estrés del retículo. El virus de arteritis equina (VAE) es un ejemplo de virosis que modula de manera positiva el proceso de apoptosis celular. Para el estudio de apoptosis se han utilizado varios modelos in vitro de líneascelulares como Vero, BHK-21 y RK-13 y cepas diferentes en cada uno de los estudios resultando difícil extrapolar los resultados obtenidos.Objetivo: El objetivo de este trabajo fue evidenciar cambios morfológicos asociados a la apoptosis en cada una de las líneas celulares infectadas mediante tinción con Naranja de Acridina/Bromuro de Etidio. Del mismo modo, se analizaron cambios genéticos de expresión mediante la activación de caspasa 3 y de la vía extrínseca de apoptosis vía caspasa 8, como así también mediante el análisis de la fragmentación del ADN celular.Metodología: Las diferentes monocapas de cada una de las líneas celulares mencionadas, fueron infectadas con la cepa Bucyrus de referencia a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 y se recolectaron muestras entre las 24 y 96 hs post infección dependiendo de la línea celular utilizada. Las monocapas celulares sin infectar y cultivos celulares en presencia de Staurosporina fueron utilizados como controles negativos y positivos respectivamente. Para el análisis de cambios morfológicos asociados a la apoptosis se tiñeron las células con Naranja de Acridina y Bromuro de Etidio y analizaron al microscopio de fluorescencia. La activación de las caspasas se realizó in situ en cada uno de los cultivos mediante el empleo de anticuerpos específicos y el revelado empleando Aminoetilcarbazol (AEC) como sustrato de la peroxidasa. La fragmentación del ADN celular se realizó mediante la extracción de ADN y la corrida electroforética en geles de agarosa.Resultados: En las tres líneas celulares se evidenciaron cambios morfológicos correspondientes a la apoptosis a las 24 hpi para las Vero y RK-13 y a las 48 hpi en BHK-21. La fragmentación del ADN se observó a diferentes hpi para cada línea celular: 48, 72 y 96 hpi para las RK-13, Vero y BHK-1 respectivamente. La activación de la caspasa efectora 3 se detectó en las tres líneas celulares, mientras que la caspasa 8 indicativa de la vía extrínseca de apoptosis no se detectó en las células BHK-21 a ninguno de los tiempos estudiados.Conclusión: El VAE induce cambios morfológicos en las tres líneas celulares y a una cinética de activación diferente en cada una de ellas de acuerdo a la fragmentación del ADN celular. Si bien el mecanismo de apoptosis fue evidenciado en las tres líneas celulares mediante la activación de la caspasa 3, la vía extrínseca de apoptosis mediante caspasa 8 no pudo detectarse en las células BHK-21.