Caracterización in vitro del aislamiento NC-Argentina LP1 de Neospora caninum ¿potencial candidato vacunal?.

CAMPERO, L.M. ; DELLARUPE, A. ; RAMBEAUD, M.; UNZAGA, J.M. ; MORÉ, G.; VENTURINI, M.C.

Congreso; I Simposio Internacional y X Jornadas y Reunión Anual de la Asociación Argentina de Inmunología Veterinaria; 2017

SOMEVE

Neospora caninum es un protozoario de vida intracelular obligado, responsable de abortos en los bovinos. Dado que no existen tratamientos y/o vacunas para controlar la enfermedad, es necesario conocer las características biológicas de nuevos aislamientos, para seleccionar potenciales candidatos vacunales. En Argentina se obtuvo el primer aislamiento de origen bovino a partir del cerebro de un ternero asintomático congénitamente infectado que se denominó NC-Argentina LP1. El objetivo del presente trabajo fue determinar la virulencia del mismo en un modelo in vitro evaluando la tasa de invasión mediante el uso de anticuerpos monoclonales (MonAb) dirigidos hacia antígeno de superficie 1 (NC-SAG1) específico del estadío del taquizoíto de N. caninum. Se realizaron 3 ensayos independientes; en cada uno se utilizaron 2 placas de 24 pocillos con cubreobjetos redondos de 15 mm y se sembraron 105 células VERO/pocillo. Una vez formada la monocapa, se infectó con 104 taquizoítos purificados/pocillo del aislamiento NC-Argentina LP1 por triplicado. Se incluyeron 3 pocillos con similar dosis de taquizoítos de NC-Spain 7, como aislamiento de referencia de alta virulencia y 3 pocillos sin infectar como control negativo. Una de las placas se lavó a las 4 hs post-infección (pi) para eliminar los taquizoítos que no invadieron hasta ese momento, mientras que la otra placa no se lavó. Los datos obtenidos se utilizaron para evaluar la capacidad de invasión de los taquizoítos antes y después de las 4 hs pi. Se incubaron las placas en estufa durante 48 hs pi. Se cuantificó la tasa de invasión marcando a los taquizoítos con los MonAb anti-SAG1 y se utilizó un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Alexa 488 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, EE.UU.). Los núcleos de las células se tiñeron con el colorante nuclear DAPI (DAPI Nuclei Acid Stain, Molecular Probes, Invitrogen). Los cubreobjetos se montaron sobre un portaobjeto y se observaron con microscopio de epiflourescencia (Leica, Wetzlar, Alemania). Cada nueva vacuola parasitófora (VP) o placa de lisis (PL) se interpretó como un taquizoíto que invadió y multiplicó. Se definió a la tasa de invasión (TI) como el número de eventos (VP o PL) por pocillo a las 4 hs (TI4hs.) y 48 hs pi (TI48hs.). Las diferencias entre las TI4hs. y TI48hs. de NC-Argentina LP1 y NC-Spain 7 se evaluaron mediante la prueba U de Mann-Whitney con un nivel de confianza de 95%, usando el programa GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, EE.UU.). Se observaron diferencias significativas en las TI4hs. y TI48hs. para ambos aislamientos, siendo identificadas mayoritariamente VP en los dos tiempos. Para el aislamiento NC-Argentina LP1 se registraron las siguientes TI (promedio): TI4hs.=699 y TI48hs.= 1700 (p< 0,0001) y para el aislamiento NC-Spain 7: TI4hs.=1182 y TI48hs.= 2077 (p< 0,0001). Cuando se compararon las TI de los 2 aislamientos a las 4 hs. (p= 0,0006) y 48 hs. (p= 0,0106) se detectaron diferencias significativas. Las TI de NC-Argentina LP1 fueron inferiores a las TI registradas para NC-Spain 7. Estos resultados permiten concluir que el aislamiento NC-Argentina LP1 posee una reducida virulencia respecto a la cepa de referencia. Por otro lado, también indicarían que los taquizoítos no pierden la capacidad de invasión tras 4 hs. pi dado que el promedio de TI48 hs. es superior al promedio de TI 4hs. Si bien es necesario complementar con estudios de proliferación in vitro y evaluar la patogenicidad del aislamiento en modelos in vivo, los resultados del presente trabajo son alentadores y permiten proponer al aislamiento local NC-Argentina LP1 como posible candidato vacunal para el diseño de vacunas de reducida virulencia.