Vitrificación de embriones murinos en cápsulas beem

BEZENZETTE, GM.; CARTAGENOVA, ME.; GULÍN, E.; LORENZO, MS.; MARURI, A.; TELLO, MF.; LOMBARDO, DM.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Jornada; V Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2015

Secretaría de Ciencias y Técnica - Escuela de Graduados (FVET-UBA)

La criopreservación de gametas y embriones se ha vuelto una herramienta indispensable para la conservación de recursos zoogenéticos. La vitrificación es una técnica basada en el uso de soluciones con alta concentración de crioprotectores que mediante un rápido enfriamiento evitan la formación de cristales. Numerosos métodos y soportes se basan en minimizar el volumen de las soluciones de vitrificación, optimizando el proceso. A pesar de la utilización de dichos métodos, poco se conoce sobre sus efectos a largo plazo. El objetivo del presente trabajo fue obtener embriones murinos para ser criopreservados por el método de vitrificación en cápsulas de inclusión BEEM® y evaluar su viabilidad post desvitrificación. Hembras CF1, de 8 semanas de edad fueron superovuladas administrando por vía intraperitoneal 5 UI eCG y 5 UI de hCG 48 h después, procediendo al apareo monogámico con machos CF1 de 9 semanas de edad. Al día siguiente se evaluó la presencia de tapón vaginal (TV) y se realizó el desapareo. Luego, las hembras con TV fueron eutanasiadas en dos tiempos: 74 h (T1) y 90 h (T2) post hCG. Los embriones fueron recuperados por lavaje uterino con medio TCM 199-Hepes 25 mM + 5% SFB, penicilina y estreptomicina (SL). Luego fueron expuestos a la solución de equilibramiento (50% de solución de vitrificación + 50% de medio TCM 199-Hepes) durante 5 min y posteriormente a la solución de vitrificación (15% EG, 15% DMSO, 0,5 M sacarosa, 20% SFB en TCM 199-Hepes 25 mM) durante 1 min. Finalmente, los embriones fueron colocados con el mínimo volumen en las cápsulas BEEM® y sumergidos en N2 líquido. Para desvitrificarlos, las cápsulas se colocaron en agua a 37°C agregando 50 µL de solución de calentamiento (TCM 199-Hepes + 1M sacarosa) durante 3 min. Luego se realizaron lavados sucesivos con SL y se mantuvieron atemperados hasta su evaluación. La viabilidad embrionaria se determinó a través de la tinción vital con ioduro de propidio y Hoechst 33342 bajo microscopio de epifluorescencia. El tiempo óptimo de recuperación embrionaria fue T2 obteniendo mórulas compactas y blastocistos (estadio trasferible), mientras que en T1 se recuperó una menor cantidad de embriones de pocas blastómeras. La viabilidad para T1 fue 75% (n=4) mientras que para T2 fue 86% (n=36). Estos resultados preliminares indicarían que dicho método de vitrificación es una alternativa para criopreservar embriones de mamíferos. Se continuará realizando ensayos in vivo de transferencia embrionaria no quirúrgica para evaluar el efecto de esta técnica sobre distintos índices reproductivos.