Relación entre la morfología de COCs inmaduros porcinos y el desarrollo in vitro de embriones

TELLO, MF.; LORENZO, MS.; LUCHETTI, CG.; MARURI, A.; CLAVER, JA.; SALAMONE, D.; LOMBARDO, DM.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; 2º Congreso Internacional de la Sociedad Argentina de Tecnologías Embrionarias; 2014

Sociedad Argentina de Tecnologías Embrionarias

Relación entre la morfología de COCs inmaduros porcinos y el desarrollo in vitro de embriones Tello MF1, Lorenzo MS1, Luchetti CG2, Maruri A1, Claver J1, Salamone DF2, Lombardo DM1 1Cátedra de Histología y Embriología, INITRA, FCV, UBA; 2Laboratorio de Biotecnología Animal, FAUBA El objetivo del trabajo fue determinar si la morfología de los COCs inmaduros de porcinos está relacionada con la apoptosis, los porcentajes de maduración ovocitaria y el desarrollo embrionario posterior a la fecundación. Los COCs se obtuvieron por aspiración de folículos de 3-8 mm a partir de ovarios de cerdas de faena. Se clasificaron bajo lupa estereoscópica en seis categorías (A1, A2, B1, B2, C y D) según su morfología. Se determinó el porcentaje de ovocitos con apoptosis temprana por la técnica de Anexina V-Ioduro de Propidio y la apoptosis tardía por la técnica de TUNEL. Las categorías A1, A2 y B1 (cumulus íntegro) se maduraron in vitro durante 44-48 h en medio TCM 199 suplementado con 10% (v/v) de fluido folicular porcino, 50mg/L de gentamicina y 0,5 mg/L de FSH y LH porcinas. Se denudaron (hialuronidasa 1mg/mL) y tiñeron con Hoechst 33342 para determinar el porcentaje de maduración nuclear. Aquellos ovocitos en estadio de Metafase II y con extrusión del primer corpúsculo polar se consideraron maduros. Se realizó fecundación in vitro y se comparó el desarrollo embrionario de las categorías A y B1, se agruparon A1 y A2 ya que no difirieron en maduración nuclear ni apoptosis. Semen fresco porcino de fertilidad probada fue centrifugado 3 veces (490 x g, 5 min) en medio BO + 2,5 mM glucosa, 10 mM Na lactato, 5 mM cafeína y 20 IU/mL heparina y diluido ½ en BO+10 mg/mL FAF-BSA (concentración de espermatozoides= 1 x106/mL). Los ovocitos maduros denudados y los espermatozoides se coincubaron en gotas de 100 µL por 30 min a 39 °C, 5% CO2 y humedad 100 %. Los presuntos cigotos se enjuagaron en medio TALP-HEPES y se cultivaron en gotas de 50 µL de medio SOF a 39 °C, 5% CO2, 5 % O2 y humedad 100 %. Se determinó el porcentaje de clivaje a día 4 de cultivo y de blastocistos a día 8-9. Se utilizó el software Infostat (v2011), realizando pruebas de independencia y regresión para evaluar apoptosis, ANOVA para los porcentajes de maduración y test de Fisher para los porcentajes de clivaje y blastocistos, considerando significativo un p≤0,05. El porcentaje de apoptosis temprana en ovocitos inmaduros aumentó al disminuir la calidad de los COCs, sin embargo no se observaron diferencias entre las categorías A1 y A2 (n= 363). No se observó apoptosis tardía en ovocitos inmaduros. No se observaron diferencias significativas en el porcentaje de maduración nuclear entre A1, A2 y B1 (n= 106), así como tampoco en el porcentaje de clivaje ni de blastocistos entre A1+A2 y B1 (n=306). En conclusión, la apoptosis en COCs inmaduros está relacionada con su morfología. A pesar de las diferencias en apoptosis, los ovocitos que están rodeados por una única capa completa de células del cumulus (B1) tienen la misma capacidad de desarrollo in vitro que aquellos con cumulus denso y abundante (A1 y A2). La observación del cumulus en los COCs inmaduros puede servir como criterio de selección de ovocitos con buen potencial de desarrollo in vitro. Relation between immature porcine cumulus oocyte complexes morphology and in vitro embryo development Tello MF1,Lorenzo MS1,CG2Luchetti,Maruri A1,J Claver1,Salamone2DF,Lombardo MD1 1Department of Histology and Embryology, INITRA, FCV, UBA, 2Animal Biotechnology Laboratory, FAUBA The aim of this study was to determine relationship between COCs morphology and apoptosis, oocyte maturation rate and subsequent embryo development. The COCs were obtained from ovaries of slaughter sows by aspiration of 3-8 mm follicles. Under a stereomicroscope they were classified by morphology into six categories (A1,A2, B1, B2, C and D.) The percentage of early apoptosis in oocytes was determined by Annexin V-propidium iodide technique and that of late apoptosis by TUNEL assay. The categories A1, A2 and B1 (complete cumulus) were matured in vitro for 44-48 h in TCM 199 medium supplemented with 10% (v / v) porcine follicular fluid, 50 mg / L gentamicin, 0.5 mg / L porcine LH and FSH. COCs were denuded (hyaluronidase 1mg/mL) and stained with Hoechst 33342 to determine nuclear maturation rate. Those oocytes at metaphase II stage and with extrusion of the first polar body were considered mature. Fertilization was performed in vitro and embryonic development of the categories A and B1 was compared. A1 and A2 were pooled because they did not differ in nuclear maturation or apoptosis. Fresh boar semen with proven fertility was centrifuged 3 times (490 x g, 5 min) in BO medium supplemented with 2.5 mM glucose, 10 mM Na lactate, 5 mM caffeine and 20 IU/mL heparin and diluted ½ in BO with 10 mg/mL FAF-BSA (sperm concentration= 1 x106/mL). Sperm and denuded oocytes were incubated in 100 µL drops for 30 min at 39°C, 5% CO2 and 100 % humidity. Presumptive zygotes were washed in TALP-HEPES medium and cultured in 50 µL drops of SOF medium at 39°C, 5% CO2, 5 % O2 and 100 % humidity. The percentage of cleavage was determined on day 4 of culture and blastocyst on day 8-9. Infostat software (2011v) was used and regression tests of independence were performed to evaluate apoptosis - ANOVA for percentages of maturation and Fisher´s test for the percentages of cleavage and blastocyst considering significant p ≤0.05. Early apoptosis in immature oocytes increased with the declining quality of the COCs. However, no difference between A1 and A2 were observed. No TUNEL-positive oocytes were found in any immature COCs (n = 363). No significant differences were observed for the percentage of nuclear maturation among A1, A2 and B1 (n = 106), nor cleavage and blastocyst rate between A1+A2 and B1 (n = 306). In conclusion, the presence of apoptosis in immature COCs is related to morphology. COCs containing at least one layer of cumulus cells completely enclosed around the oocyte (B1) have the same ability to develop in vitro than those with dense and plentiful cumulus (A1 and A2).Therefore the observation of cumulus cells in immature COCs can be useful as selection criteria of oocytes with good development potential in vitro.